讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-7

      《 Western Blot條帶分析中如何計(jì)算ImageJ的滾球半徑？》提出，ImageJ軟件Subtract Background設(shè)置面板中的Sliding Paraboloid和Disable Smoothing兩個(gè)選項(xiàng)的設(shè)置，對(duì)Western Blot條帶圖像定量分析數(shù)據(jù)可靠、精準(zhǔn)十分重要。
       本文嘗試探索Sliding Paraboloid算法的涵義，為其在Western Blot條帶蛋白定量分析中的合理運(yùn)用提供理論依據(jù)。

一、關(guān)于Sliding Paraboloid算法涵義的理解

       關(guān)于Sliding Paraboloid選項(xiàng)，ImageJ用戶指南有如下描述：
       if checked, the ‘rolling ball’ is replaced by a paraboloid that has the same curvature at the apex as a ball of that radius.
       Nevertheless, the ‘sliding paraboloid’ is also an approximation, since it does not use a in fact paraboloid but it rather slides parabolae in different directions over the image.
       ［備注：在進(jìn)行圖像背景扣除條件的設(shè)置時(shí)，勾選Sliding Paraboloid選項(xiàng)后，軟件將把該圓球半徑應(yīng)用于軌跡頂點(diǎn)弧線曲率半徑，構(gòu)建平滑的拋物線模型取代圓球模型，把虛擬拋物線軌跡縱橫方向上所觸及的信號(hào)強(qiáng)度范圍通通視為背景，從圖像原始像素強(qiáng)度值中予以扣除。］
       The ‘sliding paraboloid’ typically produces more reliable corrections since the ‘rolling ball’, a legacy algorithm (only kept for backward compatibility), is prone to edge artifacts.
       ［備注：平滑拋物線模型比經(jīng)典圓球模型具有更可靠的背景校正效果。原因是經(jīng)典圓球?qū)μ蕹x區(qū)信號(hào)主峰兩翼邊緣末段部分背景時(shí)，容易殘留背景信號(hào)（artifacts）。］
       指南目前，關(guān)于sliding paraboloid亟需澄清的關(guān)鍵問題包括：
       首先，edge artifacts到底是指什么，為何rolling ball經(jīng)典算法存在edge artifacts的問題，而sliding paraboloid則可以有效克服？
       其次，sliding paraboloid既被視為rolling ball的迭代算法，它是否適用于Western Blot條帶定量分析的背景扣除？
       再次， 軟件虛擬的平滑拋物線到底是平拋線，還是彈道拋線線？
       最后，引入sliding paraboloid算法設(shè)置，到底對(duì)Western Blot條帶定量分析結(jié)果有何影響？

       我們引用《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實(shí)測(cè)-上》的一組實(shí)測(cè)結(jié)果，來逐一探究以上問題。

二、sliding paraboloid在Western Blot條帶定量分析中的作用實(shí)測(cè)

       分析方法：對(duì)Clarity Max組Western Blot實(shí)驗(yàn)的條帶2建立ROI（規(guī)定為初始值Raw組），采用軟件默認(rèn)smoothing設(shè)置（規(guī)定為SM組）、smoothing疊加sliding paraboloid（SP）設(shè)置的（規(guī)定為SM+SP組），分別進(jìn)行背景扣除，調(diào)用【Plot Profile】功能和【Measure】，觀察組間選區(qū)圖像有效信號(hào)強(qiáng)度分布、圖像背景強(qiáng)度分布和分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果的區(qū)別。

2.1 選區(qū)圖像有效信號(hào)強(qiáng)度分布曲線變化

       圖1是背景扣除前該Western Blot條帶選區(qū)的圖像信號(hào)強(qiáng)度分布的峰形圖。圖中可見，主峰左右兩側(cè)圖像背景存在落差，信號(hào)走勢(shì)曲線兩翼的末段長(zhǎng)而低平。從選區(qū)右側(cè)邊緣第13列像素開始，曲線突現(xiàn)轉(zhuǎn)為低平，有明顯拐點(diǎn)。

       從外形上分析，規(guī)整的圓球弧線難以與曲線末端良好接觸，很可能第14列像素的背景扣除失真、失效的情況。

       圖2是顯示，經(jīng)默認(rèn)smoothing算法疊加經(jīng)典Rolling ball算法生成背景并扣除后，信號(hào)主峰右翼邊緣曲線出現(xiàn)“斷裂”的痕跡，實(shí)際是曲線下限低于參考背景“地平線”而淹沒在參考線一下所致。

       說明采用smoothing算法，使靠近處于選區(qū)外圍的第14像素列信號(hào)強(qiáng)度高出處于選區(qū)內(nèi)側(cè)第13列像素信號(hào)強(qiáng)度的異常情況。

       圖3是經(jīng)默認(rèn)smoothing算法疊加sliding paraboloid算法修正背景后，選區(qū)圖像信號(hào)強(qiáng)度分布形勢(shì)。結(jié)果顯示，信號(hào)曲線末段，即選區(qū)內(nèi)第14列像素信號(hào)曲線淹沒于“參考地平線”以下。說明該算法扣除背景后，選區(qū)外圍圖像信號(hào)強(qiáng)度低于內(nèi)側(cè)像素的強(qiáng)度值，情況正常。 

       用Plot profile在對(duì)出現(xiàn)信號(hào)淹沒的選區(qū)13-14列像素范圍局部放大，發(fā)現(xiàn)SM組和SM+SP組，峰形曲線末段走勢(shì)截然不同：圖4顯示的是SM組末端上楊，而圖5則顯示，SM+SP組的末端呈下行走勢(shì)。

       根據(jù)條帶信號(hào)強(qiáng)度分布一般規(guī)律和滾球背景扣除原理，ROI圖像有效信號(hào)強(qiáng)度理應(yīng)離ROI中心越遠(yuǎn)信號(hào)越弱，直至消失。據(jù)此判斷，SM背景扣除方案對(duì)于該ROI選區(qū)不適用，而SM+SP設(shè)置方案則合理可行。

2.2 選區(qū)測(cè)試結(jié)果

       采用實(shí)測(cè)中條帶1、條帶2和條帶6共3個(gè)條帶的測(cè)試值，下表按順序分別列出了各條帶初始值、SM組和SM+SP組的測(cè)試值。

表1  WB條帶SM和SM+SP組分析數(shù)據(jù)列表

       從測(cè)試結(jié)果看，所有條帶，無論是SM組和SM+SP組，所建立的分析選區(qū)ROI的Min值均為0，背景扣除無明顯異常，符合《ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則》的要求。
       所有條帶的IntDen值，加入sliding paraboloid選項(xiàng)后，SM+SP組與SM組相比會(huì)升高。以條帶3IntDen值為例，SM+SP組比SM組升高幅度達(dá)5.5%。

2.3 選區(qū)圖像背景信號(hào)分布曲線

       ImageJ軟件的rolling ball經(jīng)典算法和sliding paraboloid，針對(duì)同一個(gè)分析選區(qū)計(jì)算后生成的圖像背景有何區(qū)別？

2.3.1經(jīng)典rolling ball算法生成的選區(qū)背景

       圖6的信息顯示，滾球算法生成的背景首、尾兩端信號(hào)強(qiáng)度點(diǎn)分別為109.0 - 100.9。背景剖面類似于平拋線。
2.3.2 sliding paraboloid算法生成的選區(qū)背景

       圖7顯示，sliding paraboloid算法生成的選區(qū)背景首、尾兩端信號(hào)強(qiáng)度點(diǎn)分別為108.9 - 101.2。

       對(duì)比可知，生成的拋物線兩端落差略小，起點(diǎn)更低，止點(diǎn)高。提示，sliding paraboloid的末段離信號(hào)峰分布曲線更近，使得選區(qū)邊界像素的信號(hào)更多被去除）。

       把兩個(gè)背景剖名疊加后可以看出：sliding paraboloid背景頂部呈現(xiàn)的曲線整體走勢(shì)更平緩，起點(diǎn)和中部更低平，曲線末段斜率略微減小；曲線以下空間（背景）小于滾球曲線。通俗地概括sliding paraboloid背景曲線特點(diǎn)就是，低頭尾巴放低身段增信號(hào)。
       下面的圖例源自此前Western blot條帶圖像實(shí)測(cè)分析中ImageJ軟件平滑拋物線算法生成的其他圖像背景信號(hào)分布曲線，具有一定的代表性，可以有助于將sliding paraboloid算法邏輯理解的形象化。

       從這些采用sliding paraboloid算法的Western Blot條帶圖像分析結(jié)果看，推測(cè)ImageJ軟件會(huì)根據(jù)設(shè)定的ROI條件和sliding paraboloid設(shè)置，自動(dòng)調(diào)整優(yōu)化拋物線的位置，以便與圖像信號(hào)曲線走勢(shì)實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的匹配。

三、討論

        因Western Blot實(shí)驗(yàn)中條帶形狀、信號(hào)強(qiáng)弱以及周圍背景條件不一，使得條帶分析選區(qū)圖像信號(hào)強(qiáng)度分布Plot圖千姿百態(tài)。 ImageJ圖像分析軟件所用的背景扣除圓球弧線和平滑拋物線算法，自身曲線走勢(shì)特征，與條帶ROI選區(qū)內(nèi)邊緣圖像信號(hào)強(qiáng)度曲線之間的匹配程度存在區(qū)別。而信號(hào)曲線與背景扣除曲線之間距離大小，決定了圖像信號(hào)中被去除與保留的程度不一。造成了兩種算法對(duì)圖像分析選區(qū)邊界像素的背景扣除效果的區(qū)別。
       按照rolling ball算法原理，經(jīng)典圓球?qū)x區(qū)內(nèi)部處于超長(zhǎng)低平信號(hào)地帶的像素背景扣除少而保留信號(hào)多，使得在背景扣除后，圖像上ROI最外圍像素呈現(xiàn)出異常升高，在Plot圖上表現(xiàn)為曲線末段出現(xiàn)不連續(xù)（斷裂）和末端抬頭上翹現(xiàn)象，這無疑有悖常理。分析認(rèn)為，這部分無法被滾球有效消除的殘余背景信號(hào)，即是ImageJ指南中所謂的edge artifacts。我們稱之為rolling ball算法的“邊緣效應(yīng)”。可預(yù)見的是，主峰兩翼曲線末段越長(zhǎng)、走勢(shì)越低平，圓球背景扣除效果越差。
       而平滑拋物線末段比同等半徑的圓弧線平直，使拋物線更有機(jī)會(huì)貼近強(qiáng)度信號(hào)曲線的末端，對(duì)于帶有明顯拐點(diǎn)的低平末段曲線匹配更好，因此對(duì)消除圖像選區(qū)信號(hào)微弱的邊界像素背景，有更好表現(xiàn)。我們把這種現(xiàn)象稱之為Sliding Paraboloid算法的“邊緣優(yōu)化效應(yīng)”。

       基于有限實(shí)測(cè)經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)可觀察到，對(duì)暗底白條型Western Blot實(shí)驗(yàn)圖像條帶定量分析中，Sliding Paraboloid算法引入，往往會(huì)拉高ROI的強(qiáng)度積分值，還經(jīng)常出現(xiàn)ROI的Min值大于0的情況。而大多數(shù)的條帶，即便擁有低平信號(hào)末段的選區(qū)， rolling ball也可以實(shí)現(xiàn)背景扣除目的。因此，Sliding Paraboloid選項(xiàng)不是萬能的，也非剛需。

       我們認(rèn)為，Sliding Paraboloid選項(xiàng)在Western Blot實(shí)驗(yàn)條帶定量分析背景扣除設(shè)置中，典型適用指征為：當(dāng)選區(qū)圖像強(qiáng)度主峰的邊緣部分強(qiáng)度信號(hào)急劇衰減，Plot圖上曲線急轉(zhuǎn)低平并于出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)，可考慮采用平滑拋物線算法以便更有效地去除邊緣像素的背景。
       我們建議：在評(píng)估ROI曲線走勢(shì)和條帶選區(qū)邊緣背景基礎(chǔ)值，確認(rèn)末段曲線難以與圓球曲線匹配，且經(jīng)Sliding Paraboloid算法修正后的圖像信號(hào)曲線走勢(shì)合理，則應(yīng)該優(yōu)先考慮Sliding Paraboloid算法的分析數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)