讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-8

       在ImageJ軟件Subtract Background設置面板中，Disable Smoothing選項是其中一個事關選區(qū)背景扣除和分析結論成敗的關鍵性條件。
       本文接續(xù)Western Blot條帶分析中如何設置ImageJ軟件的背景扣除選項的話題，討論Disable Smoothing設置和運用方法。
       要掌握Disable Smoothing的要義，首先須弄清ImageJ圖像分析軟件中Smoothing的涵義。   

一、ImageJ用戶指南對關于Smoothing功能的說明

1.1 ImageJ用戶指南關于Smooth命令描述
       ［29.1 Smooth］：Blurs the active image or selection. This filter replaces each pixel with the average of its 3×3 neighborhood；
      ［29.11.5 Mean］：Smooths the current image by replacing each pixel with the neighborhood mean.
      【歸納起來，Smooth命令是一個用于對當前活動圖像或選區(qū)模糊處理的濾鏡功能。其模糊算法的原理是，將每個像素的強度值用其鄰近3×3區(qū)域內像素的平均值來取代。】
      ［29.14 Subtract Background］：For calculating the background (‘rolling the ball’), images are maximum filtered (3×3 pixels) to remove outliers such as dust and then smoothed to reduce noise (average over (3×3 pixels).
      【Smoothing命令用于采用滾球算法計算選區(qū)背景時，采用鄰近3×3像素區(qū)域的平局值替代該像素實際強度值的方法，濾除圖像中因灰塵、實驗背景等所致明顯高于周圍3×3像素范圍均值的異常像素，使圖像的背景過渡平緩?！?br/>      Image J軟件主界面，當鼠標在當前激活的工作圖像掠過時，狀態(tài)欄會實時顯示鼠標所在位置像素的強度值（pixel intensities）和X-Y坐標值（coordinates）。
      如圖1所示，狀態(tài)欄同時顯示以鼠標當前所處像素為中心的左、右共三個像素B (x28,y16)、A(x29,y16)、C(x30,y16)的強度值。

       紅色標識的像素A(x29,y16)自身原始圖像強度值為129（本例為圖像灰度值）。
      按Smoothing算法，以像素A為中心，把其上、下左、右相鄰共9個像素圈選形成一選區(qū)（見圖2），區(qū)域內像素強度均值代表像素A的圖像強度值。
 

       圖2顯示，正方形活動選區(qū)共包括9個像素，強度均值Mean為131.4，即像素A的smoothing計算值。顯然，smoothing值大小會因A像素位置而異。

1.2 ImageJ指南關于Disable Smoothing選項設置的說明
       ImageJ指南同時暗示了圖像背景扣除條件并非必須采用Smooth一個算法。如背景扣除中確須禁用Smooth算法，則需勾選【Disable Smoothing】選項。
      Disable Smoothing的涵義與Smoothing正好相反。ImageJ指南關于Disable Smoothing有如下描述。
      ［29.14 Subtract Background］：With Disable Smoothing checked, the unmodified image data are used for creating the background.
      【如選中Disable Smoothing，則依照原始圖像數據而非濾鏡處理后圖像數據來創(chuàng)建選區(qū)背景。】
      Check this option to make sure that the image data after subtraction will never be below the background.
      【勾選Disable Smoothing選項，以確?？鄢尘昂蟮膱D像數據不會低于背景信號強度?！?/span>

二、關于Smooth和Disable Smoothing算法涵義的疑問
       從指南以上關于Smooth和Disable Smoothing的介紹看，要完整清晰地理解Disable Smoothing算法還存在諸多疑點。這些問題的澄清，對在Western Blot條帶圖像分析中合理運用或禁用Smoothing算法，無疑具有積極意義。
       首先， Smoothing用3×3像素區(qū)域均值取代圖像中強度值異于鄰近像素的算法，實現削峰填坑。對于背景較為均勻的圖像，剔除個別、細小異常像素，無疑可確保圖像背景計算更合理。但Western Blot實驗條帶圖像中，背景均勻分布的理想狀態(tài)不多，而條帶邊緣與強度較高的大片背景區(qū)密切接觸、或條帶被背景帶斜穿的情形反而更常見。此時，采用Smoothing算法是否適用？
       其次，指南指出了采用Disable Smoothing算法可以確?？鄢尘昂蟮倪x區(qū)像素強度值不會低于背景信號強度。但前提必須是，選區(qū)邊緣部分像素信號強度要高于或等于背景像素，否則縱然有Disable Smoothing加持，減法做完后，邊緣像素有效信號也是“資不抵債”。這是否暗示：在基于圖像灰度值分析時，暗底白帶型Western Blot條帶圖像是DSM背景扣除算法的理想適用對象？
       最后，Western Blot條帶圖像分析中， Disable Smoothing和Smoothing兩種相反的背景扣除算法，其作用功效到底有何區(qū)別？是應該針對不同圖像背景條件可以按照“一帶一景”原則擇優(yōu)錄取，還是二者只有一個算法是適用的？
      為解決以上疑點，我們通過實測，探究兩種算法在WB條帶蛋白豐度定量分析的實際表現和對分析結果的影響。

三、將Smoothing和Disable Smoothing算法運用于WB條帶分析實測
3.1測試目的和方法
      據《ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則》一文介紹的方法和流程，采用《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測》文中所用的有代表性的條帶信號-背景分布圖像，采用相同滾球半球，分別采用Smoothing（簡寫為SM）和Disable Smoothing（簡寫為DSM）背景扣除選項，測試引入兩種背景算法對圖像扣除的表觀效果和選區(qū)分析結果的影響。
      主要步驟和方法包括：
      (1)點 擊【process】→【Subtract Background】菜單，調出Subtract Background面板；
      (2) 勾選Create Background（don't sunbtract）生成SM組圖像背景，通過【Plot profile】命令，生成SM組背景信號曲線圖譜。
      (3) 在（1）步驟后，勾選Create Background + Disable Smoothing選項，生成DSM組圖像背景，再生成DSM組背景信號曲線圖譜。
      (4) 將SM組、DSM組圖像背景曲線圖疊加比較，結果證實，SM組背景曲線的起點和整體水平明顯高于DSM組曲線。

3.2 圖像表征情況的對比
      條帶1的ROI分別用SM、DSM兩種算法扣除背景后，圖像發(fā)生的變化見Fig.3。

      從圖3看，SM、DSM兩個測試組圖像的區(qū)別是：
      圖像ROI邊緣如圖3紅色標示區(qū)域，SM組圖像呈現出內外跨界、集中連片信號強度“消失”的景象（測試顯示，像素強度值為1-3范圍，肉眼難以辨識）。而DSM組選區(qū)內同等位置像素圖像強度下降但依然處于可視狀態(tài)。
      最關鍵的是，直觀觀察感知SM組的圖像整體亮度低于DSM組。而ImageJ的Meaure測試結果顯示，SM組Mean值、IntDen值分別為33、16435，而DSM組Mean值、IntDen值分別為35、17197；SM則測試值低于DSM組，這與肉眼辨識的結論一致。
      據Rolling ball算法原理，在滾球半徑相同情況下，相同ROI，SM組測試值低于DSM組，唯一合理的解釋便是：SM組的滾球起點更高而抬高運行軌跡整體水平，與信號強度曲線更近，造成了背景扣除程度更多保留信號更少所致。

      SM組測試值低，說明該算法所得的選區(qū)背景強度高于DSM組生成的背景。

       考慮到SM計算值因采樣像素所處周邊像素信號-背景條件格局不一而異。我們選擇常見的代表性條帶類型，進行進一步測試。

3.2.1 峰形完整型條帶

      β-actin-B1條帶的圖像信號分布曲線走勢平緩自然，圖像背景勻和，背景強度較低。

       背景扣除結果（Fig.6）顯示，SM算法生成的背景曲線起點和終點值均不僅明顯高于DSM組的背景曲線起止點信號值，并且曲線軌跡整體與DSM組軌跡分離。

3.2.2 背景穩(wěn)定型條帶

      Clarity Max-B3條帶背景強度較高，條帶信號峰左右兩翼有拐點，末段均呈現平緩、平直走勢。綜合圖像背景分布情況，把像素列1-14設定分析選區(qū)。

      結果（見Fig.7）顯示，SM組背景信號曲線最低點在末端，該值與DSM組曲線的起點幾乎處于同一高度。

3.2.3信號中等背景強勢型條帶

      Clarity Max-B5條帶的特點是信號主峰兩翼均有拐點，拐點外圍信號曲線呈現反彈上揚走勢。未經甑別而以演示測試為目的，以拐點為界設置ROI，出現選區(qū)外背景信號高于選區(qū)邊緣信號的情況。

      Clarity Max-B5測試結果（見Fig.8）顯示，SM組背景信號曲線末端最低點信號值，都高于DSM組曲線的起點強度值。

3.2.4 信號弱背景強勢型條帶

      Clarity Max-B9這樣條帶整體特點是，圖像信號弱而背景強，條帶走勢不規(guī)則，曲線折點處像素信號明顯低于折點外圍，ROI邊界判別充滿挑戰(zhàn)。

      以測試為目的，對這一類條帶暫以這點為界設立分析選區(qū)。背景扣除結果，類似于Fig.8。SM組曲線走勢明顯高于DSM組。

      測試進一步證實，SM算法生成的選區(qū)背景強度整體上高于DSM組算法背景。當選區(qū)外圖像背景強度高于選區(qū)內圖像信號時，SM算法生成的背景曲線將明顯高于DSM算法所得曲線。
      基于有限的測試結果得出的初步結論是：在暗底白帶型Western Blot圖像條帶分析中，SM算法的選區(qū)分析值低于DSM算法測試值。

四、討論
       誠如《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測》指出的那樣，在CCD結合ECL化學發(fā)光檢測技術應用于直接Western Blot實驗檢測日益普及的現狀下，采用圖像的灰度值，直接對暗底白帶型原圖構建選區(qū)進行條帶定量分析，被證實是合理可行的方法之一。
      以上測試和此前類似大量實測都觀察到，在ImageJ軟件Subtract Background設置面板中，Disable Smoothing選項與背景扣除滾球半徑，是對選區(qū)分析值產生巨大影響的兩個關鍵控制條件。因此，其設置與否，在分析中不可忽視。即便不影響實驗分組間顯著性差異結論的做出，它也會在事實上影響了分析數據的準確性，改變組間量化對比關系。
      Subtract Background的圖像背景校正的默認設置是Smoothing算法。而基于目前經驗，在對暗底白帶型WB條帶圖像的分析中，Disable Smoothing算法引入的分析值高于Smoothing算法測試值。
      按Smoothing算法規(guī)則，在計算特定選區(qū)圖像背景值時，軟件是將選區(qū)邊緣兩列像素背景理論值與選區(qū)外的第一1列圖像初始強度值平均后作為選區(qū)背景計算的起止點。計算的結果，從測試結果看是背景值明顯抬升，有效信號強度自然會被削弱。特別是當我們遵循《ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則》，認定選框外為圖像背景的基礎上，后續(xù)對據此建立的分析選區(qū)采用Smoothing算法對背景扣除加碼，顯然是不合理的。
      基于實測，我們分析，ImageJ軟件默認的Smoothing算法并非WB條帶定量分析的必然選項。相反，我們的經驗證實，Disable Smoothing算法用于暗底白帶型WB實驗圖像的條帶分析，不僅可行，且數據準確性更高。
      實際工作中，由于Western Blot實驗操作和實驗條件的系統性問題，當實驗圖像背景復雜，條帶外形不規(guī)律等，造成選區(qū)創(chuàng)建中難以準確有效界定選區(qū)邊界的情況，確認ROI選區(qū)內仍殘留有背景成份的情況下，采用Smoothing算法，作為彌補單純采用ROI設置排除背景缺陷的補充手段，應有助于消除選區(qū)背景的干擾。因此，應用于實驗數據的初步評估有一定參考價值。

參考文獻
    ［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)
    ［2］在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測(上)