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注意定勢轉(zhuǎn)移測試(Attentional Set-Shifting, AST) 是一種擬人類威斯康辛卡片分類測試(Wisconsin card sorting test, WSCT)的測試流程, 可用于檢測嚙齒類動物前額葉介導(dǎo)的認(rèn)知靈活性。認(rèn)知靈活性是指個體能夠覺察環(huán)境變化, 并能根據(jù)環(huán)境變化調(diào)整行動策略以完成目的行為程, 是個體適應(yīng)動態(tài)環(huán)境變化的認(rèn)知基礎(chǔ)。多種精神疾病, 如自閉癥、精神分裂癥、帕金森、強迫癥、注意力缺陷/多動障礙（attention deficit/hyperactivity disorder, ADHD）、抑郁癥、亨廷頓病和阿爾茨海默病相關(guān)的癡呆癥患者都伴隨不同程度和不同特征的認(rèn)知靈活性受損。近年來, AST 模型越來越多的應(yīng)用于認(rèn)知靈活性及其受損所致的精神疾病認(rèn)知障礙的神經(jīng)機理研究。

AST 測試的基本過程是訓(xùn)練動物在不同維度，如嗅覺、視覺、觸覺等，幾對刺激中辨別與獎賞物相關(guān)聯(lián)的正性刺激線索, 并建立與之相應(yīng)的策略尋找獎賞物。同時隨著獎賞物和線索關(guān)系的轉(zhuǎn)變調(diào)整已習(xí)得的策略或建立新的策略。

1、AST測試基本內(nèi)容

經(jīng)典AST 檢測模型采用七階段鑒別學(xué)習(xí)模式，根據(jù)檢測程序依次為：簡單辨別(Simple Discrimination, SD)、復(fù)雜辨別(Compound Discrimination,CD)、第一次逆反學(xué)習(xí)(Reversal Learning 1, RL1)、內(nèi)維度轉(zhuǎn)換(Intra-Dimensional shift, IDS)、第二次逆反學(xué)習(xí)(Reversal Learning 2, RL2)、外維度轉(zhuǎn)換(Extra-Dimensional shift, EDS)和第三次逆反學(xué)習(xí)(Reversal Learning 3, RL3)七個階段(Brown &Bowman, 2002)。每個動物的AST 測試過程較長(2-3 小時/只)且只能人工實時觀察和記錄動物的行為表現(xiàn), 因此研究者在整個實驗過程中都必須保持高度注意力, 測試具有相當(dāng)?shù)碾y度。

七階段AST測試程序

（注：表格中與食物關(guān)聯(lián)的線索被稱為正性線索, 其所在維度為相關(guān)維度; 而與食物無關(guān)的線索稱為負(fù)性線索, 其所在維度為無關(guān)維度。下同）

Fox (Fox, Barense, & Baxter, 2003)和Liston (Liston, Miller, Goldwater,et al.,2006)先后提出了簡化五階段AST 檢測模式。五階段與七階段AST 程序的主要差別在于測試過程不包含RL1 和RL3 階段, 僅包含五個連續(xù)的、難度不斷增加的任務(wù)階段, 即SD, CD, IDS, RL 和EDS。

五階段 AST測試程序

這兩種AST 檢測程序都包含基本關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)能力(規(guī)則形成和分類能力, 如SD 和CD), 已習(xí)得問題解決策略的調(diào)整和轉(zhuǎn)換能力(如IDS 和RL), 以及隨著環(huán)境關(guān)系變化抑制舊策略和跨維度建立新的應(yīng)對策略的能力(如EDS)五種認(rèn)知反應(yīng)。

一般來說, AST 測試不同階段中, 即簡單和低水平學(xué)習(xí)任務(wù)需要的達(dá)標(biāo)訓(xùn)練次數(shù)和錯誤率通常會低于復(fù)雜和高水平學(xué)習(xí)任務(wù)。以五階段AST 為例, 動物在AST 高難度任務(wù)階段(如RL 和EDS)的達(dá)標(biāo)次數(shù)和錯誤率通常高于低難度任務(wù)階段(如SD、CD 和IDS)。這種差異是重要的實驗證據(jù), 表明前期任務(wù)使得動物建立了注意定勢, 從而導(dǎo)致隨后的認(rèn)知轉(zhuǎn)換困難。

在AST 中RL 和EDS 是評價認(rèn)知靈活性的核心指標(biāo)。SD 和Wistar 種系大鼠是目前最廣泛使用的實驗動物。

2、傳統(tǒng)AST 檢測流程

七階段AST 檢測方法（seven consecutive stages）

長方形的測試箱由不透明的白色有機玻璃制成。白色有機玻璃分隔板將測試箱一部分用可上下垂直拉起隔板封閉作為起始區(qū), 另一部分為測試區(qū)。用透明有機玻璃隔板將測試區(qū)平分為兩個區(qū)域,每個區(qū)域內(nèi)均置有可固定陶土罐的底座。每次任務(wù)前大鼠處于起始區(qū), 拉起隔板使大鼠進(jìn)入測試區(qū)尋找陶土罐中的獎賞物。陶土罐中裝有填充物。獎賞物埋在填充物表面下2 cm。

實驗大鼠經(jīng)1 周適應(yīng)期后, 進(jìn)行AST 行為測定。從測試前7 天開始限制動物攝食，將體重逐步降低至限食前體重的80%~85%左右,自由飲水。從限食第5 天開始, 每只大鼠均進(jìn)行如下3 個階段測試。測試在單獨的房間內(nèi)進(jìn)行。每次實驗前提前1 h 將大鼠放入測試房中進(jìn)行適應(yīng)。

第一天適應(yīng)期：

首先將陶土罐放入飼養(yǎng)籠,訓(xùn)練動物從裝滿墊料填充物的陶土罐中挖掘食物,直至動物連續(xù)3 次在5 min 內(nèi)找到掩埋的食物。隨后將大鼠移入AST 測試裝置中, 使其適應(yīng)測試環(huán)境并從檢測區(qū)兩側(cè)放置的陶土罐中挖掘獎賞物, 直至動物連續(xù)3 次每次在5 min 內(nèi)找到掩埋的食物。

第二天訓(xùn)練期:

大鼠在檢測箱中分別進(jìn)行單一氣味/介質(zhì)簡單辨別學(xué)習(xí)。氣味辨別任務(wù)使用檸檬和紫檀兩種氣味, 填充物辨別任務(wù)選擇吹塑紙片和牛皮紙片兩種填充物。選擇其中一種氣味/填充物作為正性線索與獎賞物相關(guān)聯(lián), 即始終將獎賞物放在正性線索標(biāo)記的陶土罐中, 每次測試陶土罐的位置隨機放置在測試區(qū)的左側(cè)或右側(cè)。正確反應(yīng)為大鼠只挖掘正性線索標(biāo)記的陶土罐獲得獎賞物且不挖掘負(fù)性線索標(biāo)記的陶土罐。以連續(xù)6 次正確反應(yīng)作為完成訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)。

第三天測試期：

包含7 個連續(xù)的, 難度不斷增加的任務(wù)階段：簡單辨別(Simple Discrimination,SD), 復(fù)雜辨別(Compound Discrimination, CD), 第一次逆反學(xué)習(xí)(Reversal learning 1, RL1), 內(nèi)維度轉(zhuǎn)換(Intra-Dimensional shifting, IDS), 第二次逆反學(xué)習(xí)(Reversal learning 2, RL2), 外維度轉(zhuǎn)換(Extra- Dimensional shifting, EDS)和第三次逆反學(xué)習(xí)(Reversal learning 3, RL3)。各階段任務(wù)依次進(jìn)行。每一階段直到動物達(dá)到連續(xù)6 次正確反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn), 然后轉(zhuǎn)至下一階段任務(wù)。每個階段所記錄的指標(biāo)為：達(dá)標(biāo)訓(xùn)練次數(shù)、錯誤率(錯誤反應(yīng)次數(shù)與達(dá)標(biāo)訓(xùn)練次數(shù)之比)和潛伏期(每次測試時拉起隔板大鼠進(jìn)入測試區(qū)到出現(xiàn)挖掘行為的時間)。

第一階段為SD 階段, 兩個陶土罐分別以丁香和肉豆蔻氣味標(biāo)記, 以墊料為填充物。其中一種氣味(如丁香)作為正性線索, 獎賞物始終放在此陶土罐中。大鼠學(xué)習(xí)根據(jù)正性線索尋找獎賞物直到達(dá)到連續(xù)6 次正確反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)；

第二階段為CD 階段, 引入非相關(guān)維度線索(兩種新的填充物)并與兩種氣味的陶土罐隨機配對呈現(xiàn), 但其正性線索(氣味)與SD 任務(wù)相同；

第三階段為RL1 階段, 使用與CD 中相同的氣味和填充物,氣味仍為相關(guān)維度, 但先前的正性氣味線索變?yōu)樨?fù)性線索, 而先前的負(fù)性氣味線索變?yōu)檎跃€索;

第四階段為IDS 階段, 氣味仍舊為相關(guān)刺激維度, 填充物為非相關(guān)刺激維度, 但此任務(wù)中同時更換兩種新的氣味(肉桂和迷迭香)及兩種新的填充物(木珠和塑料珠)。以其中一種氣味(如迷迭香)作為正性線索, 其他與CD任務(wù)相同；

第五階段為RL2 階段, 與RL1 任務(wù)類似, 原來在IDS 任務(wù)中為正性線索的氣味此階段換為負(fù)性線索, 原來的負(fù)性線索換為正性線索；

第六階段為EDS 階段, 更換新的填充物(白紙條和褶皺紙條)及氣味(香茅和百里香)。同時此任務(wù)中填充物由不相關(guān)刺激維度變?yōu)橄嚓P(guān)刺激維度,其中一種填充物(如褶皺紙條)為正性線索, 而氣味變?yōu)榉窍嚓P(guān)刺激維度；

第七階段為RL3 階段, 與RL1 和RL2 類似, 只是EDS 任務(wù)中正性線索和負(fù)性線索互換。

為了避免位置和線索偏好, 在測試過程中隨機選擇相關(guān)維度的配對刺激物中的一個作為正性線索。同時每次任務(wù)中陶土罐的位置隨機放置在測試區(qū)的左側(cè)或右側(cè)。

3、Ugo OPERON AST測試全自動測試系統(tǒng)工作原理及優(yōu)勢

盡管 ASST 具有許多優(yōu)點，但它也存在一些核心局限性。首先，AST測試是一個耗時和勞動密集型的過程，需要訓(xùn)練有素的實驗人員的持續(xù)參與。其次，涉及的眾多變量（例如，氣味、挖掘介質(zhì)、獎勵、獎勵在碗中的位置）可能會在實驗室內(nèi)部和實驗室之間產(chǎn)生相當(dāng)大的差異;第三，實驗操作中人為錯誤潛在風(fēng)險極大（例如，獎勵氣味的倒置）。相對而言，五階段AST 測試(five consecutive stages)更具操作便利性。

Ugo Basile新開發(fā)的Operon 49500 ASST的全自動版本，是針對傳統(tǒng)全手動操作難聽的潛在解決方案，實現(xiàn)在少量人工監(jiān)督下執(zhí)行修改后但類似的 ASST 版本。與手動版本類似，OPERON 允許在執(zhí)行操作性響應(yīng)時使用可口的食物獎勵完成 ASST 的所有階段。OPERON 還提供三個維度（嗅覺、觸覺視覺和視覺）刺激變化，作為實驗對象在整個測試過程中的注意線索。這些刺激集與手動版本提供的刺激不同（特別是對于觸覺視覺維度、條件反射區(qū)域的紋理，而不是挖掘介質(zhì)）。同樣，操作性反應(yīng)，將鼻子插入鼻子戳孔而不是挖掘。

Ugo Basile Operon全自動D/ED注意力定勢轉(zhuǎn)移測試系統(tǒng)是基于常規(guī)手動五階段AST 測試原理，采用認(rèn)知操作墻取代傳統(tǒng)手動任務(wù)中的左右碗，通過自動化任務(wù)中的左右鼻子戳孔與聲、光、氣味刺激自動控制取代測試動物挖掘飼養(yǎng)籠墊料，實現(xiàn)五階段AST測試操作的全自動轉(zhuǎn)換控制。

Manual Five-stage ASST Protocol

Automated Five-stage ASST Protocol

系統(tǒng)由Operon 主機（集成顆粒分配器的操作墻）、氣味釋放控制單元和ANY-maze軟件組成。

系統(tǒng)有兩個設(shè)置完全相同的隔間，采用一扇可上下升降滑動門隔離。當(dāng)小鼠在一間隔間內(nèi)活動時（例如進(jìn)行簡單的辨別任務(wù)時），另一間隔間會自動設(shè)置好所有組件來進(jìn)行下一項任務(wù)，實驗可自動進(jìn)行。

兩個隔間，每個隔間都有一個帶燈的操作墻（operant wall with lights）、氣味輸送（odor delivery）、推拉門（sliding door）和可更換紋理地板面板旋轉(zhuǎn)裝置。

氣味輸送系統(tǒng)（Odor delivery system）配置有2個輸出通道和10個獨立流量計（flow meters）。每個通道由電磁閥驅(qū)動。氣味傳遞裝置可以在Any-Maze控制控制下，可傳輸多達(dá)10種不同的測試氣味。因為可以遞達(dá)并吸回氣體，只有鼻戳區(qū)域充斥氣味，而隔間保持無味狀態(tài)。

每個操作墻包含自動三維刺激器(視覺、嗅覺和觸覺刺激)。

每個隔間都有左右鼻子戳(nose pokes)和顆粒分配器(pellet dispenser)。通過鼻戳控制位于中間的食物分配器完成獎勵，鼻戳上方各有6種不同顏色的LED燈作為視覺刺激。

ID/ED 實驗由 ANY-maze 管理，它通過 USB控制 Operon 的所有元素（隔間地板紋理、氣味刺激的管理以及當(dāng)動物做出正確的選擇時自動給予獎勵），并收集和分析數(shù)據(jù)。實驗設(shè)置協(xié)議可以靈活更改，結(jié)果顯示為數(shù)據(jù)、圖表、統(tǒng)計信息或原始數(shù)據(jù)。

4、OPERON小鼠 AST測試全自動測試系統(tǒng)技術(shù)規(guī)格

訂購信息

OPERON AST注意力定勢轉(zhuǎn)移實驗測試系統(tǒng)設(shè)備包括雙電動控制的滑動門的測試隔間及兩個操作墻。操作墻上有食物分配器、兩個用于嗅覺刺激和記錄的鼻戳、LED燈和提供觸覺刺激的旋轉(zhuǎn)地板。

設(shè)備需與ANY-Maze控制（60000-C）、10通道嗅覺測試氣味傳遞系統(tǒng)（49550-010）配合使用。

參考文獻(xiàn)：

原三娜, 羅曉敏, 張 帆,等.大鼠注意定勢轉(zhuǎn)移任務(wù)模型的深入研究：種系和檢測程序的影響.心理學(xué)報，2014，46（12）1805-1813

Francesca Zoratto, Edoardo Pisa, Claudia Soldati, et al. Automation at the service of the study of executive functions in preclinical models.Sci Rep . 2023 Oct 6;13(1):16890. doi: 10.1038/s41598-023-43631-8.

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