美國托馬斯·杰斐遜大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過果蠅實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，習(xí)慣性在單調(diào)刺激的睡眠誘導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，對反復(fù)刺激的習(xí)慣化會降低喚醒感，并通過一種常見的機(jī)制增加睡眠傾向。

People tend to fall asleep when gently rocked or vibrated. Experimental studies have shown that rocking promotes sleep in humans and mice. However, the mechanisms underlying the phenomenon are not well understood. A habituation model proposes that habituation, a form of non-associative learning, mediates sleep induction by monotonous stimulation. Here, we show that gentle vibration promotes sleep in Drosophila in part through habituation. Vibration-induced sleep (VIS) leads to increased homeostatic sleep credit and reduced arousability, and can be suppressed by heightened arousal or reduced GABA signaling. Multiple mechanosensory organs mediate VIS, and the magnitude of VIS depends on vibration frequency and genetic background. Sleep induction improves over successive blocks of vibration. Furthermore, training with continuous vibration does not generalize to intermittent vibration, demonstrating stimulus specificity, a characteristic of habituation. Our findings suggest that habituation plays a significant role in sleep induction by vibration.

關(guān)于機(jī)械性刺激對果蠅的睡眠誘導(dǎo)研究方法：

1、睡眠分析

為了進(jìn)行睡眠分析，將3至5天大的蒼蠅進(jìn)行12小時(shí)LD或恒定光照（LL）至少3天，并在裝入試管后約2天測量基線睡眠。對于DD實(shí)驗(yàn)，將蒼蠅帶到LD直至裝載，并在切換到DD后1-2天測量基線睡眠。大約將16只雄性和16只雌性放在一起，直到將它們分別裝入裝有5％蔗糖和2％瓊脂的玻璃管中。實(shí)驗(yàn)均在25°C進(jìn)行，果蠅在22°C飼養(yǎng)。在22°C監(jiān)測1天以確定基線睡眠水平，在29°C監(jiān)測1天以激活dTrpA1通道。使用果蠅在1分鐘的容器中收集活動(dòng)數(shù)據(jù)（光束中斷） 活動(dòng)監(jiān)測（DAM）系統(tǒng)，用于測量睡眠狀態(tài)，定義為持續(xù)至少5分鐘的不活動(dòng)時(shí)間（Huber等，2004）。除非特別指出使用多光束監(jiān)視器，否則使用單光束監(jiān)視器。對于多光束數(shù)據(jù)，“計(jì)數(shù)”設(shè)置用于檢測組合的局部，光束內(nèi)運(yùn)動(dòng)和光束間運(yùn)動(dòng)，而“運(yùn)動(dòng)”設(shè)置僅用于檢測光束間運(yùn)動(dòng)。光束內(nèi)運(yùn)動(dòng)通過從計(jì)數(shù)中減去運(yùn)動(dòng)來計(jì)算。使用自定義的基于MATLAB的軟件SleepLab。

2、振動(dòng)刺激的產(chǎn)生

將活動(dòng)監(jiān)視器，監(jiān)視管和包含蒼蠅的舞臺放置在模擬多管渦旋儀（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）上方約40 cm的架子上，或使用螺釘固定在揚(yáng)聲器系統(tǒng)平臺上（圖S1 A和S6）一種）。將渦旋儀和揚(yáng)聲器系統(tǒng)放置在光溫受控的培養(yǎng)箱中。對于渦旋實(shí)驗(yàn)，將強(qiáng)度設(shè)置為3，并通過LC4光控制器控制機(jī)械刺激的持續(xù)時(shí)間和時(shí)間。對于揚(yáng)聲器系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，使用定制的MATLAB GUI生成任意頻率和幅度的音頻信號。DAM活動(dòng)監(jiān)視器牢固地固定在丙烯酸平臺上，該平臺粘貼在15英寸船用低音炮的錐體上。一臺PC將音頻信號傳送到為低音炮供電的放大器，從而驅(qū)動(dòng)機(jī)械振蕩。

3、視頻錄制和量化

對于視頻S1將果蠅裝到含有5％蔗糖和2％瓊脂的7mm×16mm×4mm孔中。使用數(shù)碼相機(jī)錄制視頻。為了對行為進(jìn)行定量視頻分析，將單個(gè)果蠅裝入裝有5％蔗糖和2％瓊脂的標(biāo)準(zhǔn)DAM監(jiān)測管（65 mm x 5 mm玻璃管）中。從ZT 1開始，對振動(dòng)的第一個(gè)小時(shí)和上一個(gè)基準(zhǔn)日的相應(yīng)小時(shí)的行為進(jìn)行手動(dòng)評分。行為分類為睡眠（不活動(dòng)時(shí)間大于5分鐘），休息（不活動(dòng)時(shí)間小于5分鐘和> 10 s），運(yùn)動(dòng)，梳理和進(jìn)食。持續(xù)時(shí)間少于10 s的不活動(dòng)被分類為與側(cè)翼期相同的行為。來自由兩個(gè)人獨(dú)立評分的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示了相同的結(jié)果模式，

4、感官反應(yīng)性分析

果蠅在持續(xù)適度的強(qiáng)光（?500 lux）下被夾帶后，暴露于變化持續(xù)時(shí)間（1 s，15 s和1分鐘）的極亮光（?15,000 lux）下。使用LC4光控制器，每隔30分鐘在交替振動(dòng)（1 h）和無振動(dòng)（1或2 h）的過程中每隔30分鐘施加一次明亮刺激。在第一個(gè)振動(dòng)周期開始后的25分鐘，開始進(jìn)行一系列的光刺激。感官反應(yīng)性的測量方法是：在刺激出現(xiàn)時(shí)在睡眠中的蒼蠅在亮光刺激后2分鐘內(nèi)開始移動(dòng)的百分比。在光刺激前10分鐘對數(shù)據(jù)進(jìn)行類似計(jì)算，以測量自發(fā)覺醒。在振動(dòng)1小時(shí)和靜音2小時(shí)的交替時(shí)間內(nèi)，每小時(shí)施加一系列1分鐘的暗脈沖，在第一次振動(dòng)發(fā)生后45分鐘開始。使用Excel確定在明亮或黑暗脈沖的2分鐘內(nèi)喚醒的熟睡蠅的百分比。

5、免疫組織化學(xué)

對于整個(gè)安裝免疫染色，將雌性大腦在4％多聚甲醛（PFA）中固定60分鐘。在PBT中洗滌3次（在PBS中為0.3％Triton-X）后，將切開的腦在1％的PBT中的正常山羊血清中于室溫封閉1小時(shí)，并在4°C下與一抗孵育過夜。在PBT中洗滌3次后，將它們與二抗在4°C下孵育過夜。兔抗GFP以1：1500使用，小鼠抗BRP在1：200，Alexa Fluor 488山羊抗兔在1：1000和Cy5山羊抗小鼠（在1：1000。Leica SP8共焦顯微鏡用于圖像處理。

6、天線消融

使用3毫米Vannas彈簧剪刀將1至2天大的蒼蠅的所有三個(gè)觸角節(jié)段進(jìn)行物理移除?；謴?fù)3天后，將蒼蠅裝入監(jiān)測管進(jìn)行睡眠分析。

7、轉(zhuǎn)基因蠅系

為了生成UAS-Gad1 shRNA構(gòu)建體，按如下所述設(shè)計(jì)在Gad1的編碼區(qū)中包含兩個(gè)21聚體（GAT TGT TGA TGT CGC GTA AGC和GGG TAT AAA CTG TCC GAG AGG）的215bp，由GeneArt合成。將合成的DNA插入pUAST載體中，并通過標(biāo)準(zhǔn)的種系轉(zhuǎn)化在iso31背景下產(chǎn)生攜帶該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因系。

8、量化與統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)測試使用GraphPad Prism 8進(jìn)行，除了以下所述的雙向重復(fù)測量方差分析。將Paired Student’s t檢驗(yàn)與Bonferroni校正配對使用，以確定振動(dòng)是否引起睡眠和活動(dòng)的顯著變化。為了比較成對的天線對（如觸角消融蠅和完整蠅），進(jìn)行了未配對的Paired Student’s t檢驗(yàn)，并且為了比較3個(gè)或更多的組，進(jìn)行了方差分析。如果各組的方差不相等，則使用Welch t檢驗(yàn)進(jìn)行方差不均或使用方差分析的Brown-Forsythe和Welsh版本。在進(jìn)行方差分析后，根據(jù)事后檢驗(yàn)的類型和數(shù)量，進(jìn)行了Dunnett’s或Sidak’s的檢驗(yàn)。進(jìn)行Wilcoxon配對對帶Bonferroni校正的正負(fù)秩檢驗(yàn)，以分析睡眠發(fā)作持續(xù)時(shí)間數(shù)據(jù)。為了分析亮脈沖和暗脈沖的可喚醒性，進(jìn)行了χ平方檢驗(yàn)，然后對多個(gè)檢驗(yàn)進(jìn)行了Bonferroni校正。比較連續(xù)振動(dòng)和間歇振動(dòng)圖5中，使用SAS v9.4執(zhí)行了兩次重復(fù)測量方差分析，其中訓(xùn)練塊為對象內(nèi)因素，連續(xù)和間歇振動(dòng)塊的順序?yàn)閷ο箝g因子。主要因素之間的所有相互作用都是顯著的，并且使用Bonferroni方法對選定的事后比較進(jìn)行了多次比較的校正。統(tǒng)計(jì)測試的詳細(xì)信息，包括p值和n，可以在圖例中找到。所有實(shí)驗(yàn)均使用獨(dú)立雜交的果蠅進(jìn)行了至少兩次。

本研究所需試劑：

多肽和重組蛋白、兔抗GFP 分子探針 、小鼠抗BRP、Alexa Fluor 488山羊抗兔、Cy5山羊抗小鼠 、16％多聚甲醛水溶液、普通山羊血清

儀器耗材：監(jiān)測系統(tǒng)、單束監(jiān)測儀 、果蠅活動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)、多束監(jiān)測儀、LC4燈光控制器、渦旋儀、培養(yǎng)箱、顯微鏡

論文鏈接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(20)31451-0?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124720314510%3Fshowall%3Dtrue