最高轉速13000-16000rpm、工作容量6×250 mL的高速角轉頭，如Beckman avanti系列立式高速離心機所用的JLA16.250和JA-14，Himac CR22N配屬的R13A等，常見于生物工程類實驗中培養(yǎng)菌體的離心收集。

       Type 19轉頭額定容量6×250mL，是含Optima XPN、Optima XE系列在內的Beckman立式超速離心機轉頭中容量最大的角轉頭，最高轉速19000rpm，轉頭內部RCF_max、RCF_av和RCF_min分別為53900×g、32100×g和13800 ×g（RCF的含義及計算方法可參考《Optima MAX-XP超速離心機轉頭的選擇對外泌體分離效果影響的分析》）。從轉速和RCF值看，它與JA-30.50（3000rpm；R_max 108860×g）、JA-25.50（25000rpm；R_max 75600×g）等同屬于高速離心機轉頭。但轉頭內部RCF強度分布極不均勻，RCF值跨度達14000 - 54000 ×g。轉頭K因子值951，遠高于JA-30.50（k因子值280）、JA-25.50（k因子值481）和JA-18（k因子值566）?？梢姡琓ype 19對納米尺度的樣品顆粒、囊泡和大分子組分的分離效率不高。那它在科研實驗中的主要應用對象是什么，實際使用率如何？

       截止至2023年9月30日，合并以“Beckman[Text Word] AND Type-19[Text Word] AND rotor[Text Word]”、Beckman[Text Word] AND Type19[Text Word] AND rotor[Text Word]檢索詞的查詢結果，在PubMed期刊數(shù)據(jù)庫中共檢索到文獻記錄118+5條。逐一核實并剔除檢索詞設置所致誤差后，實得有效實驗應用文獻103篇，刊文時間為1968年11月至2023年8月（見圖1）。

       從圖上看，Type 19轉頭運用有1694-1968、2000-2005兩個低谷和1976-1981、2018-2023兩個小高潮。第二輪高潮始于2006年持續(xù)時間長，目前仍處于上升階段。

1、Type 19角轉頭在病毒類實驗中的應用

       將人類和脊椎動物宿主病毒、慢病毒等病毒樣顆粒(Virus-like particle, VLPS)、疫苗生產(chǎn)用病毒工程載體及植物病毒、藻類病毒、細菌病毒合并為病毒類樣品后，在103個研究應用實例中，病毒類研究對象為86例（占比83.4%）。其中包括動物病毒（如免疫缺陷病毒1型、EB病毒、流感病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、單純皰疹病毒、登革熱病毒、基孔肯雅病毒Chikungunya Virus、卡波西肉瘤相關皰疹病毒KSHV、黃病毒、狂犬病病毒等23個病毒科屬）、噬菌體、植物病毒和小球藻病毒1型。研究方向涵蓋病毒感染致病機制、診斷檢測、基因分型、功能蛋白的組裝機制、特效藥物研究和病毒疫苗開發(fā)6個方面。

1.1病毒疫苗生產(chǎn)流程中的應用

       以流感疫苗擴增工藝為例。將高產(chǎn)流感病毒骨架搭載病毒HA和NA vRNA片段后克隆到pHH21載體中并轉染293T細胞，收集細胞培養(yǎng)液上清，接種到10日齡胚胎雞蛋中孵育48小時。采集尿囊腔中尿囊液（allantoic fluids），經(jīng)4℃下3500rpm離心30分鐘澄清尿囊液，再以Tyep 19角轉頭18500 rpm4℃離心2小時。收集沉淀并重懸于5mL PBS中，用相同轉頭、離心條件經(jīng)線性蔗糖密度梯度（20%-30%-35%-40%-45%和50%）純化后，收集病毒條帶用PBS稀釋，進一步以SW32 Ti水平轉頭4℃下25000rpm離心2小時除去蔗糖溶液采集病毒沉淀用于后續(xù)滅活處理。

1.2 病毒感染機制研究的應用

       基孔肯雅熱病毒（Chikungunya virus，CHIKV）是一種由蚊蟲叮咬傳播的有包膜的單股正鏈RNA病毒。CHIKV主要通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用（(endocytosis)）進入宿主細胞，被吞噬到內體(endosomes)中。內體的低pH環(huán)境觸發(fā)病毒表面蛋白構象變化，包膜和內體膜發(fā)融合形成融合孔，病毒核衣殼藉此通道進入胞質，并被分解以釋放病毒RNA并啟動復制。用冷凍電鏡斷層成像技術(cryo-electron tomography, cryo-ET)和子斷層圖像平均技術（sub-tomogram average, STA）結合的方法，可在接近天然的條件下對病毒粒子結構變化、糖蛋白構象以及膜融合過程進行捕獲和觀察。

CHIKV病毒S27毒株的制備和純化過程是：BHK-21細胞在補充有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中以37℃培養(yǎng)，在細胞病毒感染復數(shù)（multiplicity of infection, MOI）為4.0時染毒處理1.5小時。繼續(xù)培養(yǎng)25-27小時后收集培養(yǎng)基，用type 19角轉頭4℃下53791×g離心2小時將沉淀病毒，隨后在HNE緩沖液中重懸，在蔗糖密度梯度液中用SW 41Ti水平轉頭4℃下68405xg離心過夜，提取純化的病毒條帶。

1.3 病毒致病機制研究應用

       卡波西肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)基因組中K15編碼的KSHV非結構膜蛋白招募并激活幾種細胞蛋白，包括磷脂酶Cγ1（PLCγ1），NF-κB途徑的組分以及SRC家族的非受體酪氨酸激酶(Non-receptor tyrosine kinase，NRTK)成員，在炎癥信號途徑激活中發(fā)揮重要作用。為鑒定參與pK15炎癥激活途徑的細胞成分，從KSHV感染的內皮細胞中免疫沉淀pK15，并通過無標記定量質譜鑒定了相關蛋白質。研究發(fā)現(xiàn)：II類磷脂酰肌醇3激酶（PI3K-C2α）參與活化受體酪氨酸激酶的內吞作用及胞內細胞器的信號傳導，與核周區(qū)域富集囊泡結構中的pK15發(fā)生共定位。分析表明，PI3K-C2α有助于PLCγ1和Erk1/2的pK15依賴性磷酸化，并在 KSHV 裂解復制中發(fā)揮作用。

重組病毒rKSHV.219的制備方法為：在 2.5μg/ml 抗人 IgM 抗體存在下，BJAB-rKSHV.219細胞在轉瓶中培養(yǎng)4-5天后收集細胞培養(yǎng)物，先低速離心去除培養(yǎng)基中細胞和碎片，將上清0.45μm過濾器過濾后，濾液在Type 19角轉頭中4℃下15000rpm離心5小時。收集病毒沉淀，重懸于EBM-2MV培養(yǎng)基中作為HEK-293細胞病毒感染源。

1.4 慢病毒載體介導的基因敲除應用

       MYC、BMI1和BCL-XL（MBX）是已知的與細胞分化、增殖和凋亡調控有關的功能基因。p53是干細胞基因組質量監(jiān)控分子，可在轉錄水平上抑制MBX等調控網(wǎng)絡關鍵基因的表達，使多能干細胞（Pluripotent stem cells，PSCs）快速啟動分化和凋亡。

       細胞周期蛋白依賴性激酶2 (cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和CDK4主要作用于細胞周期的G1期和S期?；罨腸yclin與CDK組成的蛋白激酶復合物，促使細胞通過G1/S檢驗點進入S期，啟動DNA復制，誘發(fā)有絲分裂，驅動細胞分裂增殖。而CDK抑制劑（CDKIs）則可抑制cyclin--CDK復合物的活性。

       科研人員通過強力霉素（Dox）誘導MYC、BMI1和MBX表達手段已建立了人多能干細胞（hPSC）衍生的巨核細胞祖細胞（imMKCLs）體系以應對血小板制品短缺問題。但imMKCLs存在增殖潛能低的問題。而MKCL細胞基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，CDKIs的過表達與MKCL增殖潛能呈負相關。通過誘導MYC/BMI1/BCL-XL調控基因的過表達并沉默CDKN1A和p53，可穩(wěn)定誘導imMKCLs產(chǎn)生血小板。

針對CDKN1A和p53的基因沉默用的是攜帶有靶基因shRNA序列慢病毒載體轉染的方法。

       為提取保存于HEK293T細胞中shCDKN2A-GFP和shp53-GFP慢病毒載體，使用Optima L-100 XP超離心機Type 19角轉頭4℃下19000rpm離心4.5h沉淀病毒載體后用于下一步基因敲除操作。

1.5 病毒類樣品分離基礎操作步驟

       無論是病毒基因組結構分析、蛋白結構及組裝、抗原特征分析或慢病毒介導的基因敲除應用，都離不開病毒/病毒載體的分離純化。

       以培養(yǎng)細胞作為初始源材料的病毒樣品的分離流程，通常包括以下兩個基本操作：

1）將染毒細胞培養(yǎng)基收集，4℃低速離心去除細胞及細胞碎片，澄清上清；

2）上清用Type 19轉頭高速沉淀病毒顆粒。

       86個病毒類研實例中離心轉速/RCF及離心時間信息可查的有效記錄78例。

       含病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清液的高速沉淀操作環(huán)節(jié)，Type 19轉頭轉速設定為15000rpm-19000 rpm有62例（RCF_av 21000 - 33000×g）。另有14例報道中，沉淀病毒所用轉速介于8000-14100 rpm（RCF_av相當于6200 - 18700×g）。

       對比Beckman Type 19、Avanti系列立式高速離心機配屬的高效角轉頭JLA16.250、JA-14的工作性能參數(shù)（見表2）可知，當Type 19轉頭的工作轉速降低至14000rpm時，轉頭內部RCF強度、分離效能（參考K因子值）已跌至JA-14轉頭水準，低于JLA16.250轉頭離心性能。

表1.  Beckman Type 19角轉頭不同工作轉速下轉頭RCF值分布表

表2. Beckman Type 19與Avanti系列 高效角轉頭間工作性能參數(shù)對比表

       病毒沉時間方面，有49例設定的離心時間為2-6小時（占比超過60%）。而離心時間≤1.5小時或≥8小時的總數(shù)為29例。

2、Beckman超速離心機Type 19角轉頭在非病毒類實驗研究中應用

       Type 19角轉頭在非病毒類實驗應用僅16例，涉及解脲支原體、胞體、細胞器、細胞外囊泡、蛋白和受體等的分離。

2.1 胎盤滋養(yǎng)層細胞膜的制備

       胎盤粗膜制備流程基于1982年Pearse B. M報道的方法修改而來：采集新鮮的足月分娩產(chǎn)婦胎盤，去除淺膜、血管和臍帶后切成碎末，在冰冷 Tris-HCl 緩沖液中沖洗去除血污后，在添加蛋白酶抑制劑的2倍體積囊泡緩沖液(0.15M NaCl, 1 mM EGTA, 0.5 mM MgCl2, 0.02% NaN3, and 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)中，用Waring攪拌機以最高速度勻漿1分鐘，用JA-10角轉頭4℃下5000rpm離心30分鐘棄沉淀，上清添加10U /mL胰RNA酶、室溫下孵育30分鐘，在Type 19角轉頭中4℃19000rpm離心3小時，制備粗膜沉淀（注：原方法為4℃下RCF 55000×g離心1小時。而Type 19最大RCF僅53900×g）。

2.2 以牛主動脈制備微粒體(Microsomes)

       12-15條主動脈(aortae)在3L咪唑(imidazole)勻漿緩沖液（0.3 M蔗糖，5mM咪唑鹽酸鹽，pH 7.4）中室溫解凍后，將平滑肌層分離，用絞肉機絞碎。取1250g碎末在250 mL咪唑勻漿液中用Waring攪拌機以最大速度勻漿90秒。勻漿液用JA-10轉頭8000 rpm離心20分鐘，收集上清同時收集沉淀。將沉淀重懸于含1mM MgATP的250mL咪唑勻漿液中，重復一次均質和離心操作。將前后兩次勻漿液離心所得上清通過四層粗棉布過濾，用type 19轉頭19000 rpm離心2小時或在JA-14轉頭中14000 rpm離心3小時。收集沉淀，在300mL 0.3M蔗糖/20mM焦磷酸鈉/20mM磷酸二氫鈉/imMMgCl2/0.5mMEDTA（pH 7.1）中重懸，經(jīng)第三次均質、離心，收集并過濾上清液后，用type 19轉頭19000 rpm離心2小時，收集的富含微粒體的沉淀組分備用。

2.3 解脲支原體16S rRNA基因提取分離

       從broth cultures培養(yǎng)基中將處于對數(shù)生長期的解脲原體（Ureaplasma）收集，胞體用SDS裂解、RNase酶和蛋白酶K處理，用苯酚、苯酚-氯仿和氯仿提取分離DNA。添加乙酸鈉和乙醇后用L5-50超速離心機Type 19轉頭20000×g離心25分鐘沉淀，獲得解脲支原體DNA。

2.4 植物蛋白酶抑制劑的提取

       收集受傷番茄葉子，用液氮速凍后凍干，在Waring均質機中研磨3分鐘。將8.5 g葉片粉末與 170 mL提取緩沖液（0.1 M K-磷酸、0.3 M KCI 和 3 mm 焦亞硫酸鉀，pH 6.5）混合，用磁力攪拌器輕輕攪拌 5 分鐘后，用Type 19轉頭33456×g離心15分鐘澄清，所得上清即蛋白酶抑制劑粗提物。

3、關于Beckman 超速離心機配置使用Type 19角轉頭的討論

3.1 Type 19角轉頭的主要應用定位問題

       資料表明，Beckman立式超速離心機的Type 19角轉頭設計定位于大容量高速離心，在病毒學研究應用，特別是以培養(yǎng)菌體、細胞為初始樣品材料的病毒類樣品研究、病毒疫苗和治療特效藥物的開發(fā)方面應用，是科學合理的。采用Type 19轉頭將病毒顆粒從大體積（800mL-1600mL）樣品中通過15000rpm以上高速離心的初步沉淀，再結合容量稍小的VTi 50.1垂直轉頭、NVT 65近垂直轉頭或水平轉頭SW 55 Ti、SW 41 Ti及SW 32 Ti等完成病毒密度梯度純化，可實現(xiàn)工作流程的無縫銜接，十分便捷。此外，Type 19轉頭還可兼顧藍藻、支原體和細菌等微生物顆粒的收獲、組織細胞勻漿液的澄清和亞細胞組分的分離實驗應用。正因為此，Type 19角轉頭從Spinco L系列超速離心機起，雖經(jīng)歷Model L2、L3、L4、L5、L7、L8 、Optima L-XP直至Optima XPN、Optima XE的更新?lián)Q代，卻歷久彌新，沿用至今。隨著基因治療技術應用的拓展、AAV等工具載體技術改進和病毒性傳染病防治研究的深入，這一經(jīng)典轉頭的應用將會迎來新一輪高光時刻。

       Type 19轉頭為常規(guī)鋁合金材質轉頭，滿載情況下重達17公斤。在超速離心機上操作此般體量的轉頭，載樣重量精細配平、轉頭安裝精準就位與拆卸時輕拿輕放，無論對實驗者或超離管理人員，其安全風險不容忽視。因此，預算條件受限時，Type 19轉頭通常不會作為優(yōu)先配置的選項。

        盡管Type 19轉頭上市和應用已數(shù)十載，但迄今為止，在PubMed期刊文獻報道中出現(xiàn)次數(shù)不過區(qū)區(qū)103次。其普及程度不僅遠低于Type 90 Ti、Type 70 Ti、Type 45 Ti等Beckman立式超速離心機所屬的同類角轉頭，被公開報道的使用頻次甚至不及VTi 50、NVT 65等新型轉頭（見圖5）。Type 19宛然成了超速離心轉頭中偏安于一隅的小眾。

       與相同功能定位的JLA-16.250、JA-14比，在離心轉速不高于14000rpm的應用環(huán)境下， Type 19轉頭毫無效能優(yōu)勢可言。

       2000.01-2.23.09期間JLA-16.250與Type 19在PubMed期刊刊文報道出現(xiàn)頻次的分段統(tǒng)計（見圖6）顯示，近10余年，新型輕質J-LITE JLA-16.250轉頭（空重僅10.3公斤）有關的發(fā)文數(shù)量和報道的增長幅度，均已后來居上。

3.2 對Type 19轉頭工作條件設置的準確描述問題

       多年來，對離心機和轉頭的資料上傾向于強調轉頭的最高轉速、最大RCF和最大工作容量指標，無意中忽視了轉頭的Rav、R_min及K因子值等性能參數(shù)。這一做法對實驗者的消極影響有2方面。一是概念上的誤解，二是轉頭工作參數(shù)設定的困擾。

       轉頭標示的最大相對離心力（注：RCF為最大離心加速度值或最大離心力場強，相對離心力為習慣法），是轉頭工作時產(chǎn)生的RCF理論極限值。在剔除離心管/瓶壁厚度、配套適配器壁厚度后，轉頭實際最大RCF值要小轉頭額定RCF值，且RCF_max只適用于離心管底部最外側這一極小范圍，除此之外管內任一位置樣品所承受的實際RCF強度都不使用。樣品管內大部分區(qū)域內樣品所承受的RCF強度均小于RCF_max。與R_max位點越遠，樣品工作有效RCF越小。

       Beckman離心機控制系統(tǒng)是基于對轉速精準控制計算出轉頭對應的RCF_av。Type 19以額定最高轉速運行時，系統(tǒng)計算顯示的RCF值33860×g為RCF_av而非RCF_max。事實上，該轉頭是無法按設定RCF=54000×g的要求來運行的，RCF值只能設定為不高于33900×g。但應用實例中，將Type 19轉頭工作RCF值報告為54000×g、53000×g、48500×g、35000×g的錯誤不在少數(shù)。

       只關注RCF_max而忽視影響轉頭分離效能的RCF_av、R_min這兩個關鍵技術指標，容易誤導實際工作中對轉頭轉速或RCF設定。當Type 19轉頭以12000rpm轉速運行時，轉頭RCF_max達到21000×g，但離心瓶內部RCF_av 大小約13500 ×g，RCF_min強度更是低至5540 ×g。此時，離心瓶內側樣品承受的RCF值介于5540 - 13500 ×g。10000×g以內RCF強度，通常被認為難以將病毒顆粒從培養(yǎng)基中有效、完整沉淀。而實驗報告中Type 19轉頭RCF設定為100000×g或9846×g用于病毒沉淀，明顯有誤。

       美國衛(wèi)生與公眾服務部公共衛(wèi)生服務疾病控制和預防中心Gwong-Jen J. Chang等對組織細胞培養(yǎng)基中VLPs離心操作參數(shù)是這樣描述的：在Beckman Type 19轉頭中4℃下19000rpm離心過夜，從轉染質粒pCB8SJ2的中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）細胞培養(yǎng)基中濃縮分泌的抗原，并重懸于TNE緩沖液（50mM Tris，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.5）至原始體積的1/200。據(jù)文中轉頭型號、工作轉速和離心時間、離心溫度信息，讀者運用于同類實驗離心工作條件設置和優(yōu)化。此外，亦可標注主機型號、轉頭型號和RCF設定值替代轉頭型號及工作轉速信息。

3.3 病毒類樣品沉淀操作中Type 19替代轉頭選擇問題

       當進行AAV或慢病毒載體和VLPS等病毒類樣品沉淀分離、微粒體等亞細胞組分制備等對RCF有較高要求離心實驗，而手頭無Type 19轉頭可用時，基于Type 19轉頭RCF_av值34000×g、RCF_min值14000×g的特點，可有兩種轉頭替代方案。

       首選是Avanti  J-E、Avanti J-26XP、Avanti J-XN 26和Avanti J-XN 30立式高速離心機JLA-16.250方案：轉速16000rpm，并適度延長離心時間。

       其次是Type 45角轉頭方案：用94mL Quick-Seal Ultra-Clear或81mL thickwall超速離心管，轉速28000rpm，每輪可完成900-1000mL樣品濃縮處理。

       當Type 45、JLA-16.250兩款轉頭都無法獲取時，還可采用JA-18轉頭方案：采用100mL Ultra-Clear超速離心管或94mL離心瓶，轉速18000rpm，參考原Type 19離心時間設定或適度縮短時間，每輪運行離心940-1000mL樣品。

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