Invitrogen iBright FL1500, 是美國賽默飛公司2019年上市的一款主要針對Western Blot免疫印跡多色熒光檢測應(yīng)用而推出的多功能成像分析系統(tǒng)。它隨機(jī)標(biāo)準(zhǔn)配置包括l藍(lán)綠色LED透射儀、SDS-PAGE染色凝膠白光屏（White trans-illuminator screen）、熒光濾光片套件、印跡參考樣品（iBright Imaging System Sample Blot / Reference target）、安全防護(hù)眼鏡（Safe Imager Viewing Glasses）和PC端iBright Image Analysis Software。既支持熒光印跡（一張印跡膜上可同時檢測綠色、橙色、紅色、遠(yuǎn)紅外和近紅外5種熒光）、HRP和AP底物的化學(xué)發(fā)光印跡和顯色法（如Ponceau S、MemCode染色）蛋白印跡成像檢測，還可用于熒光染色、顯色和染色的核酸、蛋白質(zhì)凝膠的成像分析。

       在Western Blot多功能成像分析領(lǐng)域， Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System (1708280，2013)/ChemiDoc MP Imaging System (12003154，2020)、GE Amersham Imager 600 RGB（AI600, 2014）/ ImageQuant 800 Fluor（AI800, 2019）、UVP ChemStudio Plus Imaging Systems（2013）等老牌強(qiáng)手環(huán)伺左右，此時Invitrogen iBright FL1500的入場，略顯得姍姍來遲。  

       據(jù)阿拉斯加科技2022年10月完成的一項調(diào)查顯示：從2013年11月-2022年10月，以“ChemiDoc MP[Text Word]”為檢索條件在PubMed期刊數(shù)據(jù)庫共查到52篇article。而以“iBright [Text Word] AND FL1500 [Text Word]”作關(guān)鍵詞檢索，共獲得152條記錄。

       業(yè)界流行“后發(fā)優(yōu)勢”一說。那iBright FL1500在吸收了“前輩”的技術(shù)精華后，到底煉就何等吸“睛”大法，逆襲躋身強(qiáng)林的？為此，我們推出《撥開云霧見月明——英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術(shù)特點解析》系列文案，從硬件配置到軟件模塊4個角度，對iBright FL1500進(jìn)行剖析，以期我們對該產(chǎn)品為代表的Western熒光成像分析儀、連帶Western ECL成像系統(tǒng)有更深入的了解。

一、多功能熒光檢測應(yīng)用

       對上述使用iBright FL1500 Western熒光成像儀實施檢測的152個應(yīng)用實例，按檢測樣品類型分類統(tǒng)計結(jié)果顯示：

表1  iBright FL1500 Western熒光成像儀檢測應(yīng)用舉隅

        表1信息表明，iBright FL1500 Western熒光成像儀應(yīng)用實例中，80%屬于化學(xué)發(fā)光Blot檢測（enhanced chemiluminescence Blot，ECL）；熒光測定類應(yīng)用的占比不足20%，主要包括蛋白Blot、熒光標(biāo)記蛋白凝膠、熒光標(biāo)記核酸凝膠和微生物克隆板熒光檢測。20%的比例雖不算高，但足以證明樣品熒光類應(yīng)用不可或缺。

       凝膠成像分析儀（如Bio-Rad GelDoc Go、Axygen GDBL-1000）和多數(shù)印跡化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（如Bio-Rad ChemiDoc、ChemiScope 6100BZ和ChemiScope 6200），標(biāo)配通常是302nm波長紫外透射光源，無法激發(fā)Cy5（Ex 649nm，Em 670nm）、Cy3（Ex 552nm，Em 570nm）、SYPRO Orange（Ex 470nm，Em 570nm）等凝膠熒光染料，或激發(fā)SYBR Green（Ex 498nm，Em 522nm）、SYBR Gold（Ex 490nm，Em 540nm）、Gel Green（Ex 500nm，Em 530nm）難以達(dá)到最佳分析效果。最關(guān)鍵的是，Western ECL成像儀缺少特異性熒光濾光組件，而凝膠成像儀則熒光濾鏡、冷CCD都缺失，因此，都無法勝任微弱熒光信號的采集。

       因此，既配置有透射紫外（Trans-UV）和(或)透射藍(lán)光（Trans-blue）激發(fā)光源，又擁有多組特異性熒光激發(fā)-發(fā)射濾光組件和冷CCD的Western熒光成像分析儀，自然成為SYPRO Orange、SYBR Gold等熒光染料標(biāo)記凝膠樣品檢測的理想方案。

表2 主流品牌Western多功能成像分析系統(tǒng)熒光檢測模塊配置表

        Western熒光成像分析儀，顧名思義，是可用于單重（singleplex）或多重（multiplex）熒光標(biāo)記印跡的圖像采集與分析。熒光印跡檢測技術(shù)（fluorescent Blot）比ECL印跡分析法究竟有何技術(shù)優(yōu)勢？我們認(rèn)為，熒光蛋白印跡檢測的優(yōu)勢主要是“三高”，即高特異性、高效率和高分辨力。

1、熒光Blot檢測的高特異性

       幾乎所有原核和真核細(xì)胞樣品，在熒光檢測過程中都不同程度地存在與檢測信號無關(guān)的自發(fā)熒光。樣品內(nèi)源成份（如組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成成分和代謝物）、樣品處理中引入的外源物質(zhì)（如組織固定所用的多聚甲醛等）和樣品所用器材（如試劑和轉(zhuǎn)印膜），都可能助長這種背景熒光信號。其中一些組分無需激發(fā)光誘導(dǎo)即可產(chǎn)生自發(fā)熒光，如作為細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的膠原蛋白（Em 350-450 nm），細(xì)胞內(nèi)核黃素（Em 550 nm），動物及細(xì)菌樣品中的維生素A（Em 500 nm）等。
        紅藍(lán)綠色自發(fā)熒光的存在，連同電泳、轉(zhuǎn)印過程的誤差，往往使ECL法印跡圖像背景增強(qiáng)，Blot條帶-背景反差削弱，檢測信噪比(S/B)降低。當(dāng)然，自發(fā)熒光與測試熒光基團(tuán)的光譜如存在重疊，則背景熒光同樣會干擾樣品熒光Blot分析，降低測試靈敏度和準(zhǔn)確性。

       熒光印跡分析依托熒光濾光片組件和低溫冷CCD檢測器進(jìn)行。帶寬優(yōu)化光學(xué)濾片，可將激發(fā)光源、樣品和印跡膜自發(fā)熒光等高效濾除，只允許波長特異性熒光信號進(jìn)入CCD，Blot圖像中背景信號被極大削弱。

(上圖：通過多個熒光通道獲取的熒光圖像及疊加后效果；下圖：用iBright FL1500采集的ECL Blot條帶成像后再手工合并圖像)

       對比熒光Blot和用于發(fā)表的ECL印跡（原圖經(jīng)反相轉(zhuǎn)換成經(jīng)典放射性自顯影底片的效果）圖像，不管是添加偽彩色的多色熒光疊加圖還是單色熒光圖，熒光Blot圖像都顯得更背景更“干凈”，條帶與背景對比反差更大。一張圖上可呈現(xiàn)所有檢測對象。
       圖像的基礎(chǔ)背景低，條帶定量分析時，條帶信號經(jīng)背景扣除處理后所保留的有效值更高，對弱信號條帶檢測分辨力的提高極為有利。

2、熒光Blot檢測的高分辨力

       蛋白質(zhì)磷酸化修飾和去磷酸化，是調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)及細(xì)胞的增殖分化等生理病理過程啟動的一個重要分子開關(guān)。通過檢測蛋白質(zhì)磷酸化，了解特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞受到多種生物和非生物脅迫刺激時的磷酸化水平變化情況，有助于理解蛋白質(zhì)在其中所發(fā)揮的調(diào)控功能和內(nèi)在機(jī)制。

       Western Blot 與ELISA、激酶活性分析及質(zhì)譜，都是檢測蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到膜上，采用磷酸化特異的抗體可精確識別蛋白磷酸化氨基酸位點，實現(xiàn)對蛋白磷酸化水平的定性、定量分析。

       因磷酸化修飾所引起蛋白分子量變化非常微小，磷酸化及非磷酸化兩種不同狀態(tài)的蛋白，經(jīng)凝膠分離后的條帶往往緊貼、重疊，這給ECL化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法區(qū)分這兩種蛋白組分帶來難以克服的困難。而此時，Western多色熒光檢測技術(shù)則正好可以大顯身手。

      如圖所示，原本空間位置相互重疊的MAPK信號通路ERK家族成員，ERK1/2(p44/42)總蛋白和發(fā)生磷酸化修飾的ERK1/2（Phospho-p44/42），分別經(jīng)自特異性一抗錨定，再采用DyLight 800、StarBright B700兩種不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗檢測，借助于兩個熒光通道，分別采集到出紅色（磷酸化修飾的ERK1/2）、綠色（ERK1/2總蛋白）兩種信號。兩個通道的圖像經(jīng)疊加可見，在圖像同一個位置，同時呈現(xiàn)出紅色、綠色和紅綠復(fù)合形成的黃色信號窄帶。疊加圖上紅、綠兩種信號的條帶邊界重疊難以分辨，但在不同熒光通道內(nèi)，各條帶邊界則清晰分明，為分析各條帶提供了極大便利。

      而目前已知的蛋白翻譯后修飾方式多達(dá)20種以上，除磷酸化，乙?；⒎核鼗?、甲基化也都屬常見蛋白修飾方式并參與機(jī)體多樣化生命過程調(diào)控。使用多重?zé)晒庥≯E檢測技術(shù)，研究人員用3-4個熒光基團(tuán)標(biāo)記多種蛋白質(zhì)，每種蛋白質(zhì)的檢測信號在不同熒光通道中采集，從而達(dá)到在同一印跡上一次檢測多種蛋白質(zhì)（不受蛋白間的分子量大小的影響），可區(qū)分在復(fù)雜生物學(xué)調(diào)控路徑中各蛋白的角色定位。操作過程無須裁膜、無須逐一剝離蛋白組分，簡便高效。

3、熒光Blot檢測的高效性

      Western熒光成像分析系統(tǒng)所配置的熒光檢測通路，決定了印跡可同時分析的目標(biāo)蛋白的種數(shù)和印跡檢測所適用二抗熒光基團(tuán)的光譜屬性。

      表2信息顯示，主流品牌型號的熒光通道配置數(shù)量、濾光片光譜截止范圍雖有一定差異，但可發(fā)現(xiàn)以下共同點：

      1）綠色熒光通路（Em525/BP20nm）：適用于SYBR Gold、SYBR Green、GelSafe等；
      2）橙黃色熒光通路（Em605/BP40nm）：適用于Cy3/SYPRO Orange/Alexa Fluor 546/EB等；
      3）紅色熒光通路（Em705/BP40nm）：適用于CY5/Alexa Fluor 647等；
      4）遠(yuǎn)紅外(FIR)熒光通路（Em715/BP30nm）：適用于IRDye 680/Alexa Fluor 680等；
      5）近紅外(NIR)熒光通路（Em836/BP40nm）：適用于IRDye800/Alexa Fluor 790等。

      目前主流Western熒光成像分析儀的熒光檢測通路配置數(shù)量普遍高于2012-2013年版機(jī)型。譬如，2012版ChemiDoc MP Imaging System為3熒光通道（6位濾光片輪，預(yù)留1個空位用于化學(xué)發(fā)光檢測，1個標(biāo)準(zhǔn)顯色/白光濾片，外加綠530nm、紅605nm、深紅695nm三組熒光濾片）。2013版Amersham Imager 600 RGB設(shè)置的也是綠Cy2 (525BP20nm)、紅Cy3/EB (605BP40nm)、深紅Cy5 (705BP40nm) 三個通道。而2019版上市的ChemiDoc MP、Amersham ImageQuant 800（AI 800）和iBright FL1500，均采用了8位濾光片輪，熒光通道數(shù)量擴(kuò)充至5個。

      熒光檢測通道數(shù)量和適用光譜種類的增加，帶來至少2方面的便利。

      首先，由于樣品自發(fā)熒光多集中在藍(lán)色、綠色和紅色的可見光（波長380-700nm）范圍，新增的遠(yuǎn)紅外、近紅外外熒光檢測通道，基本避開電泳樣品中其它生物分子和轉(zhuǎn)印膜自發(fā)熒光的背景干擾，使獲得更高圖像信噪比成為可能。

      其次，熒光通道增加，使得多通道熒光應(yīng)用的組合更靈活。

      以iBright FL1500為例，熒光發(fā)射端共設(shè)置了Em1：508-537nm(Alexa Fluor 488) 、Em2：568-617nm(Alexa Fluor 546) 、Em3：675-720nm(Alexa Fluor 647) 、Em4：710-730mn(Alexa Fluor 680) 和Em5：800-850nm(Alexa Fluor 790)共5個通道。

      預(yù)留一個通道用于內(nèi)參蛋白信號檢測，再從檢測光譜存在明顯重疊的Em3 (675-720nm)和Em4 (710-730mn)中2選1后，iBright FL1500可以同時對采用Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647和Alexa Fluor Plus 800標(biāo)記四種蛋白同時檢測。

      Em3、Em4兩個通道的檢測光譜存在一定程度的重疊，而熒光染料存在主、次激發(fā)峰。當(dāng)中一個通道測試時，另一種染料的次激發(fā)效應(yīng)信號也同時被主檢測通道捕獲。這樣使數(shù)據(jù)分析的邏輯出現(xiàn)混亂：原已被分離的兩個蛋白，竟都包含有另一種蛋白信號。而事實上純屬光學(xué)通道間信號竄擾（cross-talk）所致。因此，兩個存在光譜重疊的檢測通道，在一次測試中只能用其中一個以杜絕信號竄擾現(xiàn)象。這樣一來，Western Blot成像分析儀雖配置有5個通道，實際卻只能同時使用4個通道。此現(xiàn)象不僅存在于iBright FL1500系統(tǒng)，同樣也能在新版ChemiDoc MP和ImageQuant 800 Fluor上觀察到。

      還須注意的是，就Western印跡多色熒光分析實驗而言，5通道配置系統(tǒng)實際可同時檢測的蛋白最多只能達(dá)到3種（如內(nèi)參β-actin+pAKT+AKT三種熒光同時檢測模式）。這是因為嚴(yán)格的Western Blot實驗還需要進(jìn)行TPN處理，而總蛋白的測定通常需占用一個檢測通道。