自Frits Zernike發(fā)明相襯顯微觀察技術(shù)以來，基于惠更斯—菲涅耳原理用函數(shù)方法驗證和推導(dǎo)其成像機制的研究繁多，但以問題為導(dǎo)向，從微觀視角探究困擾細胞相差成像中的偽影等圖像亮度分布失衡現(xiàn)象產(chǎn)生的必然性并提出系統(tǒng)性解決方案的，則少之又少。這種現(xiàn)狀的存在，分析起來可能是這個幾個因素造成的。

       一是硬件上，相襯技術(shù)幾乎離不開相差物鏡，而相差物鏡難免會降低熒光成像質(zhì)量。改進相差圖像品質(zhì)的努力前景不佳。二橫向?qū)Ρ瓤矗瑯邮遣捎猛干涔夤饴?，用DIC、霍夫曼觀察法所獲得的圖像，無論是圖像對比度、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)細節(jié)表現(xiàn)力均優(yōu)于相差法，且厚薄樣品通吃，明場物鏡、熒光物鏡均適用，足以替代相差技術(shù)。第三是科研考評價值上，經(jīng)典技術(shù)方法體系的二次開發(fā)與再認識的技術(shù)前瞻性、研究成果學(xué)術(shù)影響力可能不夠。這種顧慮影響了人們以此選題攻關(guān)的積極性。所以，盡管發(fā)現(xiàn)相差圖像偽影問題由來已久，但探索解決問題的實踐和成果產(chǎn)出屈指可數(shù)。

       早在2005年，Leica將新型內(nèi)置相襯技術(shù)(Intermediate Phase Contrast, IPH) 引入到DMI3000B倒置顯微鏡上。IPH是將相差物鏡內(nèi)置相位板移出，做成與環(huán)形光闌滑塊類似的獨立相襯模塊（Phase Contrast module），在物鏡與目鏡間傳輸光路的中間出瞳界面（Intermediate pupil interface）設(shè)置前置模塊（Front Module）作為相位板滑塊安裝插槽，達到了對透射光相襯調(diào)制目的，且便于根據(jù)觀察需要即插即拔。最關(guān)鍵的是，IPH方法實現(xiàn)了物鏡與相位板的分離，配置普通平場熒光物鏡不僅獲得對比度極佳的相差圖像，更契合對高品質(zhì)熒光成像的需求。

       雖然IPH相襯技術(shù)解決了相差物鏡對熒光圖像質(zhì)量潛在影響問題，但圖像偽影困擾問題依舊。                                              

       傳統(tǒng)相差顯微鏡采集的細胞相差圖像中最常見的偽影效應(yīng)是光暈，是指圍繞在細胞與細胞器外緣亮度極高的光環(huán)。它掩蓋細胞邊緣輪廓和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)細節(jié)，干擾對鏡下細胞形態(tài)和細胞功能狀態(tài)的觀察與分析。

       在經(jīng)典相襯技術(shù)誕生前，人們迫切需要找到一種能將透明相位體看起來更暗的技術(shù)方法。而有加工質(zhì)量缺陷的衍射光柵的衍射光譜中所出現(xiàn)的黑色羅蘭鬼線（Rowland ghosts），激發(fā)了科學(xué)家將細胞與光柵表明的瑕疵位點聯(lián)系起來，用光波干涉產(chǎn)生暗條紋的原理讓細胞原形畢露的靈感。當(dāng)然，細胞比機器加工失誤所致光柵局部外形要復(fù)雜得多。透射光與細胞樣品相互作用時，產(chǎn)生直射光、折射光、衍射光及雜散光。鏡下的細胞圖像是多種光波相互疊加的綜合結(jié)果，非光波干涉單一機制所決定。

       迄今為止，對光暈的產(chǎn)生機制可能有多種解釋。如折射率不同晶體間接觸界面的貝克線理論（限于篇幅在此不作討論）、衍射與直射光竄擾污染原理及角度依賴性圓孔衍射原理等。

一、細胞相差成像中的光竄擾污染

       早在Frits Zernike創(chuàng)建相襯顯微技術(shù)的過程中就已發(fā)現(xiàn)，如直射光亮度遠高于衍射光，則鏡下視野背景亮度過高，掩蓋光波干涉產(chǎn)生的暗條紋圖案，則無法進行相襯觀察。當(dāng)直射參考光的亮度削減至入射前的1/9時，其亮度與衍射光亮接近，相干疊加后圖像對比度較為理想。

       實驗觀察的細胞樣品中，培養(yǎng)基液面深度通常都大于細胞和細胞團塊厚度。細胞和培養(yǎng)基的折射率約為1.33-1.38，無論是透射光或衍射光，穿透液面時，因折射造成出射界面位點偏移入射方向而出現(xiàn)透射光傳播方向的偏移。而偏移程度與樣品層的折射率、樣品層厚度相關(guān)。發(fā)自環(huán)形光闌經(jīng)透鏡聚焦形成的X型傾斜光，疊加折射所致光路偏移后，光傳播方向更分散、不規(guī)則和難以有效約束[1] 。因此，倒置相差顯微鏡下所謂的“直射光”，盡管透射光束主體走向比較集中，大部分光將從相位板共軛區(qū)經(jīng)過，但必有少量“直射光”因傳播方向偏移較大，逃離共軛光環(huán)區(qū)而進入相位板補充區(qū)。

       因此，有一種比較流行的說法是，光暈是因樣品中衍射光和直射衍射光在相位板的共軛區(qū)與補償區(qū)結(jié)合部竄擾污染所致。

       當(dāng)逃逸的“直射光”從相位板補償區(qū)無損穿過時，其振幅與相位均無變化，鏡下視野的背景亮度上升，使得直射參考光（即Direct Light，下同）與衍射光（Diffracted light）相干疊加圖像中明亮條紋亮度進一步增加、面積擴大，而灰暗條紋色澤變淺。最終結(jié)果是圖像的亮度分布失衡加劇，對比度下降。而削弱穿透相位板補償區(qū)的“直射光”光量，則可降低圖像整體亮度和光暈條帶擴大化污染效應(yīng)，有利于提升圖像對比度。

       另一方面，若原本存在相位后延1/4波長的衍射光“誤入”共軛區(qū)，則這部分衍射光的相位會被提前1/4波長后，相當(dāng)于用少量照明光經(jīng)共軛區(qū)給圖像補光。而正常通行的直射參考光的相位因相位環(huán)調(diào)制而提前1/4波長。理論上，錯位衍射光與直射參考光因存在1/4波長相位差而發(fā)生相干疊，造成圖像局部參考光振幅減弱后，鏡下視野灰暗條紋振幅削弱，同樣有損暗條紋圖像的暗色。但因其光量少，對圖像整體亮度分布干擾作用遠不如“直射光”串?dāng)_效應(yīng)顯著。

       由此可見，直射光因亮度高，其竄擾污染對相襯圖像對比影響更大。而要降低圖像亮度，削弱光暈、增強圖像對比度，對直射光竄擾污染的治理是關(guān)鍵。

二、相位體尺寸依賴性夫瑯禾費衍射條紋分布原理

2.1 由夫瑯禾費衍射（Fraunhofer Diffraction）原理得出的推論

       有道是：物理的盡頭是數(shù)學(xué)。早就有先賢數(shù)學(xué)語言對波動光學(xué)中的衍射條紋分布規(guī)律做了淋漓盡致地表述。

       假設(shè)兩列傳播方向分別為A1P、A1P的子波，在P點相遇。子波從A1、A2到P點的光程r1、r2和波長決定了兩列子波此時各自的相位：

φ1 = 2π?r1 /λ , φ2 = 2π?r2 /λ  ??????????????????????????????（1）

       P點的相位差Δφ為：

△φ = 2π?（r1 – r2）/λ  ??????????????????????????????（2）

       根據(jù)惠更斯－菲涅耳原理（Huygens–Fresnel principle），從同一波陣面上發(fā)出的子波經(jīng)A1、A2，在P點相遇并發(fā)生干涉時，疊加波復(fù)合振幅A的大小由二者在P點的相位差決定。A與△φ之間的聯(lián)系可用以下公式表示:

A2 = A12 + A22 + 2A1?A2?cos(φ1 -φ2)  ??????????????????????????????（3）

       當(dāng)在P點的相位差φ1 -φ2為子波的1/2波長時，將發(fā)生相消干涉，復(fù)合振幅A最小，P點為暗斑。

       當(dāng)r1 – r2 =±Kλ（K=0,1,2,3，……）時，△φ=φ1 -φ2=π，復(fù)合振幅A最大，P點為量斑。

       因透射傳播方向的無序性，衍射-直射光參考隨P點位置改變而相位差具有多樣性，故在像平面相干疊加形成的是明暗交織的圖像。

       在經(jīng)典夫瑯禾費衍射（Fraunhofer Diffraction）過程中，來自無限遠處平行光（如倒置相差顯微鏡中，安裝在透鏡焦點上的點光源在透鏡像方產(chǎn)生的平行光）通過光學(xué)圓孔（或光學(xué)狹縫，為方便表述，統(tǒng)一圓孔為例），并經(jīng)透鏡聚焦后可在像屏上形成明暗相間的同心圓環(huán)圖案。圖案中央為衍射圓斑（艾里斑，Airy Disk），亮度最高。中心亮斑往外，為暗環(huán)-明環(huán)-暗環(huán)的交替分布。

       圓孔衍射中的圓孔直徑a、衍射角θ、衍射光波長λ之間的關(guān)系可表示為：

Sinθ = ±λ/a  ??????????????????????????????（4）

       單色光發(fā)生圓孔衍射時，圓孔直徑大，則衍射角小。圓孔小，則光衍射角大。

       衍射像面上相鄰兩個調(diào)明暗條紋中心的距離用△x表示?！鱴隨衍射角和物鏡焦距的增加而加大。

       當(dāng)θ較小時，sinθ ≈ θ，故為方便計算，中心暗斑（P0級暗斑）和相鄰的第一級亮環(huán)(稱為P1級亮環(huán)或P1級亮環(huán)）之間的△x、衍射角θ、圓孔直徑a和物鏡焦距f之間計算關(guān)系為：

△x = f?θ  ??????????????????????????????（5）

       此外，還可將△x與衍射光波長、圓孔直徑a、物鏡焦距f之間計算關(guān)系表述為：

△x = f?λ/a  ??????????????????????????????（6）

       可見，是照明光波長λ、衍射角θ、衍射圓孔直徑a和物鏡焦距f這四個因素的共同作用，決定了圓孔衍射圖像的布局。而其中，照明光波長λ、衍射角θ發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。

       實際上，所有衍射條紋，是由衍射角在0＜θ＜90范圍衍射光形成的多個寬窄不同的小衍射條紋相互重疊組合而成的。只是因不同單色光衍射條紋距離太近，肉眼可感知到的并非彩虹布局的條紋，而是由多色小條紋疊加形成的白色復(fù)合大條紋（將衍射像屏移到足夠遠的距離，衍射條紋圖像放大尺度足夠后，即可觀察到內(nèi)向外、波長由短至長、排列有序的彩色條紋圖案）。

       白光中的紅黃綠光波長長，藍紫色光波長較短。據(jù)公式（4）可知，當(dāng)圓孔直徑相同時，紅黃綠光衍射角大，藍紫光衍射角小。在同一個條紋中，紅黃綠光的衍射小條紋距離P0點比短波長藍紫色條紋要遠。而小角度藍紫衍射光的條紋分布位置靠近中心點P0，具有向心分布的特點。因此，衍射條紋中波長、衍射角度光線組成的變化，會使亮色大復(fù)合條紋的幾何寬度及條紋亮度中心位置發(fā)生向心或離心方向的偏移。

       光的波長長，則亮衍射條紋角半徑大，條紋變得粗大，亮度比較分散，與相鄰條紋中心的間距大。而波長短，則衍射條紋細，條紋光能量分布集中，相鄰條紋間距縮小，從而對暗條紋分布空間擠占更明顯，使得暗條紋變窄。故白光衍射條紋寬度大于由紅黃綠等單色光形成的衍射條紋寬度，且相鄰明暗條紋間隔更小、界限更模糊。

       而公式（6）則表明，相同衍射波長條件下，大圓孔衍射產(chǎn)生的條紋窄，光亮度分布集中，相鄰條紋，特別是明暗條紋間間距小，亮紋對暗紋分布干擾大。小圓孔衍射的條紋寬度大、條紋中心的間距大，光亮度集中程度降低，明暗條紋間的界限相對清晰，明紋對暗紋侵蝕干擾小。

2.2 用夫瑯禾費衍射原理對細胞相差觀察法光暈現(xiàn)象的分析

       組織細胞、iPS細胞團塊、3D細胞球、類器官等透明樣品皆為微米尺度的相位體，在透射光照射會發(fā)生360°全方位衍射。故采用無限遠光學(xué)系統(tǒng)的倒置相差顯微鏡生成相襯圖像，可用夫瑯禾費圓孔或狹縫衍射原理來解釋[3] 。

       經(jīng)典瑯禾費衍射重點關(guān)注的是相干波因光程差異所致的相位差和圖像亮紋的分布。而倒置相差顯微鏡中，直射參考光、衍射光在離開相位板時就已存在1/2波長的初始相位差。因此，在相差觀察模式下的衍射模型圖中，P0并非大亮斑而是尺寸大小與明環(huán)接近的暗斑，P1級圓環(huán)則是最亮、最寬的明環(huán)。從原理上講，相位板后光路衍射圖與經(jīng)典夫瑯禾費衍射圖是互為反相、黑白對調(diào)關(guān)系。

       將細胞及類器官等細胞團視為大直徑衍射圓孔，則細胞器等可看作小直徑圓孔。因此，高倍鏡下的細胞相差圖像，其實是大圓孔內(nèi)套小圓孔兩種尺寸衍射條紋疊加的結(jié)果。與經(jīng)典瑯禾費衍射觀察重心不同，細胞圖像關(guān)注重點，并非圖案中的明環(huán)，而恰恰正是圖案中心P0級暗斑。

       細胞或細胞團的直徑大，P0級衍射暗斑直徑本來就小，而緊緊環(huán)繞其周圍的是P1級明環(huán)。從圖像上看，幾乎所有細胞外緣都被亮色光環(huán)籠罩。這是因為P1級圓環(huán)光亮度極高而分布集中，與中心暗斑間距小，P1對P0“補光”，造成亮環(huán)侵蝕暗斑嚴重，掩蓋了暗斑外緣灰暗輪廓。

       光暈并不局限于細胞外緣，同樣還環(huán)繞在亞細胞器周圍。在高倍鏡下可見白光沖斥細胞器間隙。只是小圓孔衍射中的P1級明環(huán)面積大而亮度較低，且與P0中心暗斑相距較遠,所以鏡下還可以大致辨清細胞器分布位置。

       細胞外圍的光暈遮掩了細胞外緣輪廓，干擾了對細胞團的準(zhǔn)確分割、細胞的計數(shù)和細胞形態(tài)測量分析。而細胞器外圍的光暈造成細胞器結(jié)構(gòu)和界限難以辨識。

       衍射圖案中明暗條紋的寬度（即光斑直徑或圓環(huán)寬度）、間距和亮度，是由圓孔直徑和入射光條件決定的。因衍射圓孔直徑無法選擇，要克服光暈的不利影響，只能對照明光亮度、入射波長和衍射光衍射角進行調(diào)整。

       1）適度削弱透射光強度，如引入透射光中性密度濾光片（即ND濾光片，可參考《細胞圖像采集中倒置顯微鏡的透射濾光片合理使用》）下調(diào)視野整體亮度，從而降低P1級明環(huán)光量，一定程度上有助于減輕光暈。

       2）配置暖色調(diào)LED透射光源，降低光源色溫。這樣既增加了入射光的波長λ，又增大了光衍射角θ，有利于拉開條紋間距，減輕高亮度條帶對相鄰暗條紋的干擾。

       3）當(dāng)調(diào)整光源照明條件并不適用時，則調(diào)整相位板光衍射角度成為抑制光暈的必然途徑。

       無論大小圓孔衍射，復(fù)合光源照明下，P1級明環(huán)中短波長、小角度光衍射條帶的近心偏移分布，是造成明暗環(huán)帶靠近重疊的根源。剔除或削弱小角度衍射光而保留大角度衍射光，則暗斑與次級明環(huán)間距拉大，減少明暗干擾，還可使視野中心的亮度得到抑制。這或許正是Nikon公司開發(fā)的APC相差對比技術(shù)的工作原理及靈感之源。

      (待續(xù)：APC相襯技術(shù)在細胞顯微成像中運用的技術(shù)原理及啟示——下）