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故書百回讀深思子自知——MIQE指南對qPCR實(shí)驗(yàn)中核酸紫外測定的要求-上
在影響實(shí)時定量反應(yīng)檢測靈敏度、準(zhǔn)確性和可靠性的眾多因素中，核酸模板品質(zhì)與含量無疑具有決定性作用。核酸品質(zhì)（quality）是指核酸的純度（DNA/RNA、蛋白質(zhì)、酚等PCR抑制劑的殘留）和完整性（Integrity）符合要求并保持穩(wěn)定。核酸的量是指用于反應(yīng)的ng或μg核酸質(zhì)量或拷貝數(shù)?；虮磉_(dá)定量分析中，加入相同質(zhì)量的總RNA、確保每個qPCR反應(yīng)孔的cDNA模板含量均一，以確保測試值真實(shí)反映mRNA 實(shí)際水平差異、排除因cDNA用量不同所致誤差。SNP基因分型檢測中模板數(shù)量過少將影響等位基因數(shù)據(jù)有效性。而NGS測序前對測序文庫模板數(shù)量均一化是保證數(shù)據(jù)質(zhì)量不可或缺的質(zhì)控手段。
2009年發(fā)布的定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)表所必需實(shí)驗(yàn)信息最低限度標(biāo)準(zhǔn)(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) ，即MIQE指南，明確了qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)表時作者所需提供的最低信息標(biāo)準(zhǔn)，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的正確性、準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。指南從qPCR樣本的采集、處理和制備，核酸質(zhì)量控制，反轉(zhuǎn)錄、qPCR體系設(shè)定及數(shù)據(jù)分析的各環(huán)節(jié)具體要求都有詳盡闡述，為全球生命科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)的國際化標(biāo)準(zhǔn)《生物和生物醫(yī)學(xué)調(diào)查的最小信息》(Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations, MIBBI)的重要組件。
本文圍繞MIQE指南的核酸質(zhì)量控制環(huán)節(jié)中與微量紫外可見光度計(jì)應(yīng)用有關(guān)的論述內(nèi)容，結(jié)合目前學(xué)術(shù)期刊qPCR實(shí)驗(yàn)文章所披露的實(shí)際操作辦法，探討如何在qPCR實(shí)驗(yàn)流程核酸質(zhì)控中充分發(fā)揮微量紫外可見分光光度計(jì)測定功能的問題。
一、核酸品質(zhì)對實(shí)時熒光定量PCR測試性能的影響
MIQE指南中的核酸質(zhì)量控制(QC of Nucleic Acids)首先是指核酸模板的完整性（integrity，是指核酸特別是RNA的降解程度）、純凈度（核酸樣品中其他核酸模板可能干擾測定結(jié)果、抑制逆轉(zhuǎn)錄活性或PCR反應(yīng)的污染物的殘留情況）的評估。其次，是qPCR反應(yīng)過程核酸數(shù)量的測定和控制。
1.1 完整無降解的RNA模版是qRT-PCR結(jié)果可靠性的關(guān)鍵
mRNA與機(jī)體所受內(nèi)外環(huán)境條件刺激和生理狀態(tài)息息相關(guān)，其含量具高度動態(tài)性。組織器官生理結(jié)構(gòu)、取樣的時間和材料的管理環(huán)節(jié)的差異同樣影響RNA的降解。降解引起的基因轉(zhuǎn)錄水平相對差異可能會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評價產(chǎn)生誤導(dǎo)。
在RNA完整性對RT-qPCR檢測性能影響的評價實(shí)驗(yàn)中，用酶消化或紫外線處理的方法降解從牛組織中提取的完整RNA后，對18S rRNA、28S rRNA、β-Actin、IL-1b基因表達(dá)mRNA的測定結(jié)果顯示，來自同一組織的完整RNA和降解RNA樣本之間，測試值的穩(wěn)定性存在顯著差異。從高豐度18S和28S rRNA，中等豐度的β-Actin，到極低豐度的IL-1b，出現(xiàn)隨著RNA品質(zhì)提升而mRNA樣本定量結(jié)果變異性 (intraassay variation)降低的現(xiàn)象。
RNA完整性具有組織細(xì)胞依賴性、時間特異性和基因特異性。一般認(rèn)為，結(jié)締組織含量高的組織（如胃腸道）、富含RNase的器官（如胰臟），在取樣、存儲過程中RNA降解較高；細(xì)胞來源RNA樣品完整性要好于從實(shí)體組織提取的RNA。
研究顯示，降解RNA樣本測試數(shù)據(jù)變異存在高度的組織、基因特異性。某些組織中mRNA定量似乎不受RNA降解的影響，從部分降解的RNA樣本獲得的基因表達(dá)譜與完整RNA樣本相比，具有高度相似性。但有些組織mRNA數(shù)量與RNA質(zhì)量評分指數(shù)RIN存在線性關(guān)系或存在RIN指數(shù)閾值響應(yīng)關(guān)系（即部分樣品無法給出準(zhǔn)確的測定結(jié)果）。
MIQE指南總結(jié)為：擴(kuò)增片段長達(dá)400bp時，擴(kuò)增效果強(qiáng)烈依賴于優(yōu)質(zhì)RNA。而多數(shù)情況下，即便對70-250bp短擴(kuò)增子qPCR測定，耐受RNA降解程度的能力也不盡相同（即RNA完整性受損不是啥好事）。定量RT-PCR分析，高品質(zhì)RNA可縱橫捭闔、暢行無阻，而部分降解的RNA適合于短擴(kuò)增子反應(yīng)。因此，想要準(zhǔn)確地量化組間微小表達(dá)差異，在定量分析前驗(yàn)證和審視RNA質(zhì)量是有益的且極其重要。
1.2 RNA品質(zhì)對qRT-PCR擴(kuò)增效率的影響
即使是完整RNA、優(yōu)化的引物及反應(yīng)體系， 若RNA樣品中PCR抑制物濃度過高，同樣會降低qPCR檢測靈敏度和擴(kuò)增效率。
通常，人們用靶基因與內(nèi)參基因平行擴(kuò)增和用內(nèi)參對靶基因測試值歸一化的處理方法來解釋樣本間定量差異。無論相對定量還是絕對定量分析，其前體都是假設(shè)這靶、參的擴(kuò)增受到相同的抑制程度。但實(shí)際情況是，部分生物樣本可能含有的PCR抑制劑，在內(nèi)參樣本中不存在，而據(jù)此構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量基準(zhǔn)，導(dǎo)致測試樣本中mRNA水平低估，從而扭曲歸一化和定量分析結(jié)果。
包括生物樣品自身的天然組分、核酸提取純化操作用的試劑和實(shí)驗(yàn)器具攜帶的各種化合物，凡是影響DNA聚合酶的活性，干擾模板與DNA聚合酶及引物的結(jié)合，抑制PCR擴(kuò)增的化合物、鹽分，均視為為PCR抑制劑。
表1 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見PCR反應(yīng)抑制物
干擾物類型 | 污染來源 | 常見污染物 |
內(nèi)源性干擾物 (endogenous interferent） | 血 液 | 血紅蛋白(>1mg/mL)，氯高鐵血紅素(Hemin) (>0.1 ng/μL)，免疫球蛋白G(IgG)； 甘油三酯（TG）、鐵離子、膽紅素等 |
動物組織 | 蛋白酶、肌紅蛋白、膠原質(zhì)、黑色素、脂肪、糖原、膽汁鹽酸； 基因組DNA濃度和DNA結(jié)合蛋白等 | |
植物組織 | 腐殖酸(50ng/μL)、丹寧酸/鞣酸(Tannic acid)(0.1ng/μL)、多糖、多酚等 | |
藥 物 | 抗生素、抗病毒藥、激素類等 | |
牛奶骨頭 | 蛋白酶、ca2+等 | |
尿 液 | 尿素(>20mM) | |
糞 便 | 植物多糖、膽酸鹽等 | |
外源性干擾物 (exogenous interferent) | 提取試劑 | 硫氰酸胍、鹽酸胍、苯酚(>0.2%)、氯仿、十二烷基硫酸鈉(SDS) (>0.005%)等 |
有機(jī)溶劑 | 異丙醇(>0.15 IU/mL)、二甲基亞砜(DMSO)、甲酰胺(DMF)、甘油、聚乙二醇(PEG) ； 乙酸鈉(>5mM)、溴酚蘭等 | |
抗 凝 劑 | 肝素(>0.1U/mL)、乙二胺四乙酸(EDTA) (>0.5 mM)等 | |
消 毒 劑 | 醇類/乙醇(>1%)、酚類/苯酚(>0.2%)、過氧化物類、強(qiáng)酸HCL、強(qiáng)堿NaOH等 | |
土壤植物 | 礦物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)等 | |
實(shí)驗(yàn)器具 | 紫外線照射老化的聚丙烯材質(zhì)樣品管、樣本采集容器、一次性塑膠手套上的滑石粉等 |
國外的一項(xiàng)專門調(diào)查表明，約6%的研究人員關(guān)注了實(shí)驗(yàn)所用核酸樣本是否存在抑制劑的問題。
二、MIQE指南對qPCR實(shí)驗(yàn)中微量紫外可見光度計(jì)核酸測定的要求
MIQE指南的MIQE checklist列表中，涉及到紫外可見光度計(jì)應(yīng)用的是核酸提取和反轉(zhuǎn)錄兩個操作步驟。
雖然列舉的是mRNA，但其指則適用的樣品，應(yīng)理解為包括全部DNA（包括基因組DNA、質(zhì)粒、mtDNA、STR等）和RNA（涵蓋組織mRNA、miRNA、lnRNA、shRNA及病毒RNA等）類型樣品，應(yīng)用范圍既包括核酸定量，也包攬SNP檢測應(yīng)用。
表中E（essential information）標(biāo)記項(xiàng)屬須與發(fā)表文稿一起提交的基本信息（可理解為強(qiáng)制要求）；而D（Desirable information）標(biāo)記項(xiàng)為根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件盡可能提交的資料。
表2 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)核酸質(zhì)量控制的MIQE checklist
Item to check(應(yīng)檢查的項(xiàng)目) | Importance |
Nucleic acid extraction（核酸提取步驟） | |
Procedure and/or instrumentation（核酸提取程序和/或所用儀器） | E |
Name of kit and details of any modifications（核酸提取試劑盒及一切操作改動） | E |
Details of DNase or RNase treatment（DNase或RNase處理的細(xì)節(jié)） | E |
Contamination assessment (DNA or RNA)（DNA或RNA污染評估過程） | E |
Nucleic acid quantification（核酸定量） | E |
Instrument and method（核酸定量所用儀器和方法） | E |
RNA integrity: method/instrument（RNA完整性檢測方法/所用儀器） | E |
RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcripts（RNA的RIN或RQI值或Cq的3’和5’轉(zhuǎn)錄本） | E |
Inhibition testing (Cq dilutions, spike, or other)（PCR抑制測試情況Cq稀釋度、峰值等） | E |
Source of additional reagents used（核酸提取所用額外試劑的來源） | D |
Purity (A260/A280)（核酸的A260/A280純度檢測） | D |
Yield（核酸產(chǎn)量） | D |
Electrophoresis traces（凝膠電泳檢測結(jié)果） | D |
Reverse transcription（反轉(zhuǎn)錄步驟） | |
Complete reaction conditions（RT完整反應(yīng)條件） | E |
Amount of RNA and reaction volume（RNA用量和反應(yīng)體系體積） | E |
Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentration（寡核苷酸引物和濃度） | E |
Reverse transcriptase and concentration（反轉(zhuǎn)錄酶及其濃度） | E |
Temperature and time（RT反應(yīng)的溫度和時間） | E |
Manufacturer of reagents and catalogue numbers（RT試劑的廠商和貨號） | D |
Storage conditions of cDNA（cDNA保存條件） | D |
Cqs with and without reverse transcription（RT后樣品和未進(jìn)行RT的樣品的Cq值比較） | D |
綜合表2內(nèi)容和QC of Nucleic Acids一節(jié)的論述，MIQE指南對qPCR實(shí)驗(yàn)中用微量紫外可見光度計(jì)進(jìn)行核酸測定的目的、要素和要求，大致可歸納為以下幾點(diǎn)。
2.1 核酸樣品污染情況評估
MIQE指南規(guī)定，qPCR實(shí)驗(yàn)須報告所用核酸樣品中的基因組DNA/RNA、苯酚及其他PCR反應(yīng)抑制劑殘留的評估情況。而紫外可見光度計(jì)的A260/A280比值測定是一簡便而重要的評估方法。其理論依據(jù)是：在中性pH溶液中測量核酸樣品，高純度的RNA溶液的A260/A280比值為2.0，而DNA這一比值為1.8，苯酚的紫外吸收峰為270nm。如RNA樣品中存在基因組DNA的混入（降低A260讀數(shù)）或苯酚殘留，抬升A280測試值，導(dǎo)致RNA的A260 /A280比值降低。
2.2 核酸的含量測定
在qPCR實(shí)驗(yàn)要比較不同靶標(biāo)定量的結(jié)果，首先要確保qPCR實(shí)驗(yàn)流程幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)核酸樣品中的總RNA、cDNA、DNA模板用量大致相同。因此，紫外可見分光光度計(jì)A260測定核酸濃度為必選動作。
MIQE指南的有關(guān)內(nèi)容有：
1）核酸（DNA/RNA）提取產(chǎn)量（注：測定所獲的高品質(zhì)核酸OD值，根據(jù)dsDNA、RNA的μg/ μL濃度及提取物總體積計(jì)算核酸提取總產(chǎn)量，便于分配后續(xù)各項(xiàng)應(yīng)用中核酸用量）；
2）反轉(zhuǎn)錄時總RNA用量（注：市面反轉(zhuǎn)錄試劑盒常建議按RT反應(yīng)體系20μL：2μg總 RNA的投料比例配置RT反應(yīng)體系）；
3）qPCR反應(yīng)核酸模板定量（DNA/cDNA）定量（注：不同基因的cDNA合成效率不一，通常RT試劑盒無法給出cDNA產(chǎn)量值。A260測定獲得高品質(zhì)cDNA產(chǎn)物濃度和總產(chǎn)量，便于規(guī)劃qPCR反應(yīng)的cDNA用量）；
4）qPCR反應(yīng)寡核苷酸引物/探針濃度測定（根據(jù)引物合成廠家配套說明和實(shí)際A260測定結(jié)果，基于cDNA投料量來優(yōu)化反應(yīng)體系中引物體積用量，確保擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性）；
5）核酸測定所用儀器及方法
指南中，NanoDrop微量紫外可見分光光度計(jì)作為把核酸定量的首選方法。低濃度RNA樣品測定則推薦熒光RNA結(jié)合染料法（如RiboGreen和Qubit 系列熒光計(jì)）。(待續(xù))
