應(yīng)用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-9

一、TaqMan Array Card的工作特點

       TaqMan探針低密度陣列(TaqMan low-density array，TLDA)，即TaqMan探針陣列卡(TaqMan Array Card，TAC)，是依托5’-端核酸酶水解原理TaqMan探針和實時定量PCR儀這一技術(shù)平臺、采用特殊生產(chǎn)工藝和結(jié)構(gòu)制成的384孔檢測板（為方便表述，下文統(tǒng)一使用TAC簡稱）。

       TAC于2003年9月隨ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System一同推出，主要用于高通量基因表達的定量分析。最早被命名為TaqMan Array Micro Fluidic Card（微流體芯片）。目前的賽默飛官方文件和國外刊文中，已很少使用Micro Fluidic Card的名稱。檢索2006年1月-2022年2月發(fā)表的TAC應(yīng)用論文發(fā)現(xiàn)， PubMed庫中“PCR[Text Word] AND TaqMan low-density array[Text Word]”可查到1292條記錄，“PCR[Text Word] AND TaqMan array card[Text Word]”為453條記錄?！癟aqMan Array Micro Fluidic Card[Text Word]”則僅1篇文章(因“方法”的同一段落同時用了TaqMan Low Density Array card 、TaqMan Array Micro Fluidic Card兩種表述)，而“TaqMan Array Microfluidic Card[Text Word]”則查無記錄。

       其實，TAC與微流控芯片（Integrated fluid circuit），從結(jié)構(gòu)設(shè)計到工作液體控制原理都有區(qū)別。一般意義上的微流控芯片多具有復雜流路結(jié)構(gòu)，測試所需液體需由微量蠕動泵和微量控制閥控制和輸送到反應(yīng)微陣列單元。而TAC的液體流動和分配則是通過人工簡單離心操作，借助于離心力作用來實現(xiàn)每個樣品通道所轄48個反應(yīng)孔的液體均勻灌注的。因此，我們建議發(fā)表論文中的關(guān)鍵詞以TaqMan low-density array或TaqMan Array Card為宜。

       每張TAC有8個獨立液流通道，每個通道連通48個容積1-1.5μL的微量反應(yīng)孔，共384個孔。所有反應(yīng)孔兩兩對稱排列于主液流通道兩側(cè)。每個孔內(nèi)含有為目標核酸和質(zhì)控基因定制的高品質(zhì)且標準化生成的正向、反向引物（濃度約900nM）、Taqman探針（200-250nM）凍干后沉積物。

       吸取100μL預(yù)先與TaqMan通用預(yù)混液混勻的DNA或cDNA樣品，經(jīng)TAC每個檢測通道加樣口注入液槽中，經(jīng)簡單密封、離心后，裝入QuantStudio 7 Pro或QuantStudio 7 Flex、ViiA 7或7900HT Fast實時熒光定量PCR儀，即可像常規(guī)qPCR反應(yīng)一樣完成擴增反應(yīng)與分析。

       與常規(guī)384孔PCR板反應(yīng)體系的構(gòu)建須使用移液工作站或多通道移液器等額外設(shè)備協(xié)助的操作不同的是，TAC上樣只需一支200μL的單道手動移液器、一臺離心機即可完成上樣方式，實驗準備步驟簡單，不同反應(yīng)孔分注體積誤差小，實驗結(jié)果一致性和重復性好。

       每張TAC可以同時運行384個實時熒光定量PCR反應(yīng)，實現(xiàn)12-384個目標核酸同步檢測分析，實現(xiàn)了常規(guī)單重和多重實時熒光定量PCR反應(yīng)難以企及的實驗通量和效率。

二、TaqMan Array Card在生物醫(yī)學實驗研究中應(yīng)用

       TAC擁有384個PCR反應(yīng)通量，一次運行可檢測數(shù)十個甚至以百計靶標。對臨床不明原因感染性疾病病原體的快速篩查具有重要價值。美國CDC在2011年就開發(fā)出集成細菌、病毒共21種呼吸道常見病原體靶點檢測TAC，用于社區(qū)獲得性肺炎住院患者中肺炎支原體、病毒感染的鑒別。美國弗吉尼亞大學則開發(fā)了針對19種腸道病原體基因的TAC檢測卡，依托全球腸道多中心研究 (GEMS)計劃支持，在巴西、東南亞、南亞和非洲等低收入國家與地區(qū)，大規(guī)模用于小兒腹瀉、腸道炎癥的病原體的檢測。此外，TAC還被大量應(yīng)用于土壤傳播蠕蟲、血吸蟲病、隱孢子蟲、蛔蟲感染的流行病調(diào)查項目等。 

       TAC的高通量、多靶點同步檢測特性，賦予它在疾病遺傳分析、基因表達和轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機制研究、疾病診斷/治療/預(yù)后/治療耐藥性的生物標志物、生理病理活動的信號通路分析、microRNAs (miRNA）表達水平、細胞因子表達、藥效毒理學機制分析、干細胞分化等諸多領(lǐng)域巨大應(yīng)用潛力，而取得的成果可謂異彩紛呈。 

表1 2016-2021年知名高分期刊刊發(fā)的部分TAC實驗應(yīng)用文獻

        DICER1是一種編碼RNase III的基因，其突變導致miRNA功能失調(diào)極易誘發(fā)多發(fā)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（MNG）、胸膜肺母細胞瘤（PPB）、卵巢性索間質(zhì)腫瘤（SLCT）等多種腫瘤。用TAC和7900HT Fast 實時熒光定量分析系統(tǒng)，對攜帶突變型（共5個突變位點）和野生型DICER1基因的MNG、SLCT-MNG患者家族成員的外周血液淋巴細胞、MNG和SLCT組織中DICER1的miRNA進行了檢測。結(jié)果表明：DICER1突變易導致家族男性罹患MNG，而女性成員對MNG、SLCT有易感性。 

       孕激素X受體(Pregnane X receptor, PXR)為肝內(nèi)異種生物核受體，協(xié)調(diào)生物轉(zhuǎn)化酶及藥物轉(zhuǎn)運蛋白功能，參與藥物代謝和肝臟解毒過程。利福平、苯巴比妥等多種化合物均可作為激動配體與PXR結(jié)合，進而觸發(fā)肝細胞CYP3A4和CYP2C9藥物代謝酶基因、UGT1A1酶、ABCB1轉(zhuǎn)運蛋白等多種基因的轉(zhuǎn)錄。人類編碼PXR受體基因NR1I2的近端啟動子內(nèi)存在雌激素受體、糖皮質(zhì)激素受體α等結(jié)合位點。采用TaqMan Array Human MicroRNA Card，對肝細胞的754個miRNA篩選分析后發(fā)現(xiàn)，利福平治療后miR-18a-5p表達上調(diào)，但miR-18a-5p上調(diào)會抑制NR1I2表達和CYP3A4基因誘導。而糖皮質(zhì)激素不僅通過啟動子區(qū)域上調(diào)NR1I2表達，還與3′-UTR結(jié)合域上調(diào)NR1I2表達和下調(diào)miR-18a-5p的表達。由此揭示了肝細胞中糖皮質(zhì)激素對NR1I2表達調(diào)控的路徑機制。 

       血清素(serotonin) 即5-羥色胺(5-HT)，參與調(diào)節(jié)攝食、運動、記憶、疼痛及精神情緒等生理病理過程。腦干中縫背核（dorsal raphe）聚集了高密度血清素能神經(jīng)元（serotonin neuron）。用定制TAC，對切除卵巢猴子單獨用雌二醇或雌二醇+黃體酮治療前后動物腦組織中，25個與DNA修復和神經(jīng)退行性疾?。∟DDs）相關(guān)基因表達的變化。這些基因包括：DNA修復相關(guān)基因（NSB1、NTHL1、LIG4、PCNA、POLG、SHFM1、GADD45A、RAD23A、APEX1、GTF2H5、PARP2、XRCC1、SHRPH）；伴侶蛋白-熱休克蛋白基因（HSP90、HSP70、HSP60和HSP27）；泛素酶（ubiquinases）基因（UBEA5、UBE2D3、UBE3A）；轉(zhuǎn)運馬達蛋白（transport motors）基因（KIF5B、DNCLC1、DCTN4、MAPT）和4個疾病特異性基因（SCNA、ADAM10、APP和PSEN1）。結(jié)果表明：卵巢類固醇激素對血清素神經(jīng)元生存能力有益。雌二醇或雌二醇+黃體酮治療增加與DNA修復、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)降解、軸突運輸和2個正?；虻谋磉_相關(guān)的基因表達（這些基因在神經(jīng)退行性疾病中處于病理狀態(tài)）。表明這些基因?qū)?-HT神經(jīng)元表達和調(diào)控可能介導了NDDs潛在疾病過程。 

       缺氧誘導因子-1(HIF-1α)是細胞缺氧反應(yīng)的主調(diào)節(jié)因子，特異性誘導microRNA-210(miR-210)表達上調(diào)，并在介導肺血管組織中的缺氧作用方面發(fā)揮重要作用。但miR-210和線粒體間的作用機制未知。將人肺動脈內(nèi)皮細胞(human pulmonary arterial endothelial cell, HPAEC) 暴露于0.2%-12% O2條件24小時作為缺氧細胞模型，采用TAC對365種人類miRNA的表達水平進行了檢測。結(jié)果顯示：在HPAECs中，只有miR-210、miR-21、miR-26b、miR-146a、miR-146b、miR-150和miR-328經(jīng)缺氧誘導表達上調(diào)超過1.5倍，但只有miR-210的上調(diào)超過增加25倍并呈現(xiàn)氧依賴式上調(diào)。小鼠PAECs缺氧暴露后miR-210表達上調(diào)了100倍。Western Blot結(jié)果顯示，0.2% O2暴露HPAECs 細胞的miR-210水平顯著上調(diào)的同時，ISCU1/2蛋白水平出現(xiàn)顯著下調(diào)，并持續(xù)時間長達缺氧暴露60小時。提示了miR-210直接抑制ISCU1/2表達的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，與生物信息學算法預(yù)測的鐵硫簇組裝蛋白ISCU1/2是miR-210缺氧細胞反應(yīng)直接靶標的結(jié)論一致。說明缺氧時，miR-210通過在下調(diào)ISCU1/2的表達，降低調(diào)節(jié)線粒體功能的鐵硫酶、線粒體復合體I和烏頭酸酶的比活性。據(jù)此確定miR-210和ISCU1/2在缺氧應(yīng)激期間調(diào)節(jié)線粒體呼吸和代謝的功能和調(diào)控機制。 

       資料顯示，TAC在信號通路介導病理變化，藥效毒理評價、腫瘤耐藥機制、干細胞分化調(diào)控、細胞因子mRNA表達譜分析，病理標志物篩查和預(yù)后評價，基因敲除動物模型驗證、病毒感染與細胞免疫機制等方面應(yīng)用后，所取得的成果不同凡響。

（待續(xù)）