一、樣品模塊的變溫速度決定PCR實(shí)驗(yàn)效率
MIQE指南成文之時(shí)，Applied Biosystems的7300（96×0.2ml/4色）、7500 Fast（96×0.1ml/5色）、StepOne（48×0.1ml/3色）及StepOnePlus（96×0.1ml/4色）風(fēng)頭正盛。伯樂(lè)擁有MyiQ（96×0.2ml/單色）及iCycler iQ（96×0.2ml/4色），一看差點(diǎn)事，乘機(jī)并購(gòu)了MJ Research公司，把DNA Engine Opticon 2（96×0.2ml/雙色）和Chromo 4（96×0.2ml/4色）改換門庭后，又推出MiniOption（雙色）、iQ5（96×0.2ml/5色）qPCR儀。羅氏先有LightCycler 1.5（32×20μl毛細(xì)管/3色）上市，后主推大眾化的LightCycler 480 II（96×0.2ml或384孔板/6色）。同期Stratagene Mx3000P（96×0.2ml/4色）/Mx3005P（96×0.2ml/5色）因2007年美國(guó)并入Agilent而一息尚存。但eppendorf Mastercycler ep realplex2 (96×/0.2ml雙色)、realplex4 (96×0.2ml/4色）則成為了歷史。Qiagen死扛配置72×100μl、100×30μl離心式轉(zhuǎn)頭的Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，前景堪憂。
表1 部分經(jīng)典型號(hào)qPCR系統(tǒng)工作性能參數(shù)表
品牌
型號(hào) ABI 7300 ABI 7500 Fast MJ Research
DNA Engine Opticon 2 Bio-Rad
iQ5 Roche
LightCycler 480 II
上市時(shí)間 2004年 2005年 2002年 2005年 2008年
模塊升溫速率 1.6℃/s 5.5℃/s 3.0℃/s 96×0.2ml模塊:升3.3℃/s，降2.2℃/s;
雙48×0.2ml模塊:升2.2℃/s，降1.8℃/s;
384孔模塊:升2.0℃/s，降1.8℃/s; 4.8℃/s
樣品升溫速度 1.1℃/s - - - 3.3℃/s
模塊溫控精度 ±0.25℃ of setpoint ±0.25℃ of setpoint ±0.3℃ of setpoint ±0.3℃ of setpoint ±0.2℃ of setpoint
模塊溫度均一性 ±0.50℃ ±0.50℃ ±0.4℃ ±0.4℃ ±0.2℃
常規(guī)應(yīng)用中，qPCR儀工作時(shí)程是由PCR程序運(yùn)行進(jìn)度決定的。樣品溫度在變性、退火和延伸三個(gè)溫度臺(tái)階轉(zhuǎn)換的快慢完全取決于模塊變溫速度。同一個(gè)模板、相同組分體系，反應(yīng)模塊熱升降溫速度不同，執(zhí)行同一PCR程序耗時(shí)大不相同。尤其是變性-退火轉(zhuǎn)換步驟，溫差高達(dá)35-40℃，不同熱循環(huán)模塊溫度切變耗時(shí)懸殊。
以Veriti PCR儀主板預(yù)置的“常規(guī)PCR擴(kuò)增程序”為例：94℃預(yù)變性1min→95℃變性15s+55℃退火15s+72℃延伸30s共35個(gè)循環(huán)→最后72℃延伸7分鐘結(jié)束反應(yīng)→4℃保溫。每個(gè)循環(huán)中樣品處于有效工作溫度時(shí)長(zhǎng)僅1分鐘，但須經(jīng)歷一次94℃→55℃相對(duì)較慢的降溫過(guò)程和一次55℃→72℃相對(duì)快速的升溫過(guò)程。
 
如果把55℃→72℃進(jìn)程喻為田徑百米決賽，則94℃→55℃轉(zhuǎn)換過(guò)程就相當(dāng)于20公里競(jìng)走。東京奧運(yùn)會(huì)蘇炳添成績(jī)9.98s排名第六，但與冠軍成績(jī)僅區(qū)區(qū)0.18s之差。競(jìng)走決賽中，選手王凱華排名第七但要比奪冠成績(jī)落后了228s。選手速度實(shí)力差距放到拉長(zhǎng)的賽程后，就變得顯而易見(jiàn)。不同考查機(jī)型在進(jìn)行PCR循環(huán)中這一升一降兩個(gè)動(dòng)作耗時(shí)差距道理亦是如此。
qPCR儀用戶指南通常標(biāo)明了儀器安裝運(yùn)行的海拔高度、環(huán)境溫度、濕度、通風(fēng)條件參考范圍。而熱循環(huán)模塊降溫速度除了環(huán)境條件還受所加載樣品體積的制約。每個(gè)型號(hào)實(shí)時(shí)定量PCR儀實(shí)際降溫速度，除了具體現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試別無(wú)他法。我們討論模塊變溫速度，其實(shí)是基于“模塊升溫速度快，散熱效率理應(yīng)較高”的假設(shè)和經(jīng)驗(yàn)估算而已，并無(wú)真憑實(shí)據(jù)。
弱以實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀額定變溫速率估算PCR循環(huán)的升降溫過(guò)程，將得到表2的結(jié)果。
表2 PCR循環(huán)變溫過(guò)程時(shí)長(zhǎng)估算數(shù)據(jù)表
qPCR儀型號(hào) 7500 QuantStudio 1 CFX connect QuantStudio 5 CFX opus 96
模塊升溫速度 2.5℃/s 3.5℃/s 5.0℃/s 6.5℃/s 5.0℃/s
變溫測(cè)算標(biāo)準(zhǔn) 樣品升溫1℃/s
樣品冷卻 1.5℃/s 樣品變溫均速1.88℃/s 模塊變溫均速3.3℃/s 樣品變溫最大速度3.66℃/s 模塊變溫均速3.3℃/s
95→55℃過(guò)程 27s 22s 13s 11s 13s
55→72℃過(guò)程 17s 9s 6s 5s 6s
循環(huán)變溫耗時(shí) 44s 31s 19-30s 16-30s 19-30s
結(jié)果顯示，不同代差qPCR系統(tǒng)升溫過(guò)程中耗時(shí)差別可達(dá)2倍。但最大升溫速度5℃/s-6.5℃/s的機(jī)型間比較，升溫過(guò)程時(shí)長(zhǎng)區(qū)別不大。
儀器標(biāo)稱Peak Ramp Rate，是熱循環(huán)模塊按默認(rèn)最高變溫速度模式運(yùn)行時(shí)瞬時(shí)速度極限，與實(shí)際穩(wěn)定運(yùn)行升溫速度（以2-4℃居多）有相當(dāng)差距。因此，有人認(rèn)為，品牌PCR儀熱循環(huán)模塊實(shí)際變溫速度差并不大，以每個(gè)循環(huán)時(shí)差20秒、35個(gè)循環(huán)計(jì)算，時(shí)差不過(guò)12分鐘，完全可以忽略。其實(shí)這種論點(diǎn)不妥，原因有二。
一是不完全符合事實(shí)。模塊工藝技術(shù)代差相同的PCR儀，如GeneAmp 2720和伯樂(lè)Mycyler，二者完成相同protocol時(shí)長(zhǎng)固然接近。但模塊變溫性能差距拉大到一定程度后，如2720 VS SimpliAmp PCR儀，恐怕2720的慢條斯理的節(jié)奏難免遭到吐槽。這一點(diǎn)，eppendorf官方實(shí)測(cè)報(bào)告可以佐證。
 
其二論據(jù)存在疏漏。人們只盯著升溫速度，卻忽略了94℃→55℃過(guò)程降溫速度這個(gè)關(guān)鍵瓶頸因素。PCR循環(huán)相當(dāng)部分時(shí)間其實(shí)就浪費(fèi)在這一步。
若降溫速度以2.0℃/s估算，圖中的程序降溫時(shí)長(zhǎng)差不多是升溫耗時(shí)的3-4倍。7500和QuantStudio 1兩款機(jī)型降溫速率相差僅0.4℃/s，但前者耗時(shí)近30秒，后者為20s左右，完成單次循環(huán)二者耗時(shí)相差超過(guò)10秒。可見(jiàn)，在PCR熱循環(huán)中，降溫速度的微小差異會(huì)在實(shí)際運(yùn)行中被數(shù)倍放大，從而明顯拉大不同qPCR系統(tǒng)任務(wù)完成時(shí)差。伯樂(lè)Mycycler PCR儀（最快升溫速度2.5℃/秒）完成35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，耗時(shí)據(jù)稱超過(guò)2個(gè)半小時(shí)。當(dāng)今主流96×0.2mL標(biāo)準(zhǔn)模塊SimpliAmp PCR儀及QuantStudio 3 qPCR儀，完成35個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量實(shí)驗(yàn)流程，運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)不會(huì)超過(guò)2小時(shí)。
同種反應(yīng)模塊配置，快速變溫能力，意味著實(shí)驗(yàn)、運(yùn)行管理效率更高，可接待更多人次的機(jī)器使用預(yù)約。
二、樣品模塊變溫速度影響PCR產(chǎn)物特異性
在PCR儀服務(wù)工作中，屢屢聽到科研人員反映：同一個(gè)片段，用某品牌PCR儀可以有效擴(kuò)增，換個(gè)品牌機(jī)器擴(kuò)增會(huì)失敗。雖然所言具體細(xì)節(jié)難以確認(rèn)，但其實(shí)這反映的是PCR和qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性的問(wèn)題。
熱循環(huán)模塊升降溫速度對(duì)PCR產(chǎn)物特異性有影響，這在業(yè)內(nèi)是有共識(shí)的。
Eppendorf的資料說(shuō)明，PCR樣品在變性-退火-延伸三個(gè)步驟間的升降溫速率屬性，影響PCR 結(jié)果可重復(fù)性。PCR反應(yīng)模塊溫控速率的變化，會(huì)使PCR產(chǎn)物凝膠電泳帶型改變。這在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 分析（RAPD）實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)尤為顯著。此外。變溫速率的不穩(wěn)定對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的危害，類似于模塊控溫誤差帶來(lái)的干擾。
短串聯(lián)重復(fù)序列(STR) 在基因組中的重復(fù)數(shù)量在個(gè)體間呈高度多態(tài)性。采用PCR儀擴(kuò)增STR的檢測(cè)分析是物種系統(tǒng)發(fā)育、司法物證與民事親子鑒定等領(lǐng)域的重要手段。耶拿公司人士認(rèn)為，高速PCR擴(kuò)增STR具有特異性好的巨大優(yōu)勢(shì)。
說(shuō)明，不僅是PCR熱循環(huán)模塊溫度控制精確性和均一性，升降溫速度控制也影響qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定。
眾所周知，溫度準(zhǔn)確有效是PCR反應(yīng)的靈魂。表1也顯示，20年來(lái)，PCR模塊溫度控制的均一性從±0.50℃提到±0.2℃，溫控精度一直保持在±0.2-0.3℃。提高反應(yīng)模塊的溫度控制精度和內(nèi)部溫度均一性，確保PCR反應(yīng)組分盡可能處于設(shè)定的有利溫度而非偏離設(shè)定溫度，可提升PCR擴(kuò)增效率，減少錯(cuò)誤和非特異性反應(yīng)。
熱循環(huán)模塊升降溫速度影響PCR反應(yīng)特異性的原因在于，PCR模塊的快速變溫，使熱循環(huán)步驟中溫度轉(zhuǎn)換過(guò)程時(shí)間占比大幅縮短。反應(yīng)體系處于中間過(guò)渡溫度環(huán)境的時(shí)間極大壓縮，而保持在實(shí)驗(yàn)“有效溫度”的時(shí)間比例大幅增加。這相當(dāng)于提升了模塊保持有效設(shè)定溫度時(shí)間的能力。
72-95℃高溫停留時(shí)間越長(zhǎng)，PCR反應(yīng)體系蒸發(fā)進(jìn)入管內(nèi)死腔水份越多，體系濃縮越嚴(yán)重，會(huì)使PCR擴(kuò)增效率下降。而55-72℃階段，引物具有一定程度同源的核酸片段的復(fù)性延伸，爭(zhēng)奪體系中Taq酶和合成原料資源，對(duì)模板擴(kuò)增構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)抑制效應(yīng)。反之，循環(huán)過(guò)程溫度偏離設(shè)定點(diǎn)少，擴(kuò)增失誤少，必然有助于提高擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量并減少異常溫度條件下引起的非特異結(jié)合。PCR可靠性增高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性改善則順理成章。
qPCR儀誕生20多年來(lái)，當(dāng)提升模塊溫控精度和溫度均一性潛能掘盡后，改進(jìn)模塊工藝材料和溫度控制元件性能，大幅加快熱循環(huán)模塊升降溫速度，成為實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀發(fā)展史上具有里程碑意義的進(jìn)步。
目前主流qPCR儀，如伯樂(lè)最新上市的CFX Opus 96系統(tǒng)，其96-Well Fast模塊最大升降溫速率為5℃/s（平均升降溫速率3.3℃/s）。賽默飛QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的96×0.2mL模塊最高升溫速率可達(dá)6.5℃/s，而96×0.1mL模塊這一指標(biāo)已躍升至9.0℃/s。
羅氏LightCycler 2.0的毛細(xì)管離心式反應(yīng)模塊，升溫速度更是高達(dá)20℃。其初衷就在于盡可能減少溫度過(guò)渡時(shí)間，從而把樣品體系鎖定在設(shè)定溫度上，確保PCR檢測(cè)性能。三、qPCR儀快速升降溫能力讓快速PCR功能如虎添翼
一般認(rèn)為，快速PCR儀/qPCR儀意指PCR模塊具有快速變溫能力（通常升溫速度不低于5.0℃/s），比普通PCR反應(yīng)模塊可有效縮短反應(yīng)時(shí)間。業(yè)內(nèi)將升溫速度達(dá)到4℃配置0.1mL模塊的qPCR儀冠名為快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，以區(qū)別于標(biāo)準(zhǔn)0.2ml模塊機(jī)型。
而快速PCR功能是指PCR熱循環(huán)過(guò)程采用快速反應(yīng)模式。核心是qPCR儀系統(tǒng)預(yù)置快速反應(yīng)功能模式，并不局限于具備超快升降溫速度模塊。賽默飛StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，就有標(biāo)準(zhǔn)模式和快速反應(yīng)模式，雖然其最高升溫速度僅4.6℃/s。同樣的，7500 Fast（升降溫速率5.5℃/s）也支持快速模式和標(biāo)準(zhǔn)模式兩種運(yùn)行程序?？焖龠\(yùn)行功能模式，可在40分鐘內(nèi)完成標(biāo)準(zhǔn)模式下近2小時(shí)的擴(kuò)增任務(wù)。
通常，要實(shí)現(xiàn)快速PCR反應(yīng)，必須三管齊下。
一是用薄壁0.1mL PCR管或PCR板(如伯樂(lè)low-profile耗材)和專用0.1mL Fast反應(yīng)模塊。模塊升降溫迅速是基礎(chǔ)，而壁薄導(dǎo)熱迅速，加之反應(yīng)體積小，升降溫變得更敏捷；
二是壓縮熱循環(huán)各步驟的保持時(shí)間，這是有效且立竿見(jiàn)影的舉措。譬如根據(jù)模板片段長(zhǎng)度，將退火15s縮短為5-10s，延伸時(shí)間由30s縮短至10-15s。如果引物的退火和延伸溫度相差無(wú)幾，則可將它們合并，這樣變標(biāo)準(zhǔn)PCR程序變性96℃、56℃退火、72℃延伸三步為95℃變性、72℃延伸兩步后，可進(jìn)一步縮短PCR運(yùn)行時(shí)間。
三是采用高擴(kuò)增能力DNA聚合酶，這是實(shí)現(xiàn)快速PCR和PCR擴(kuò)增穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的關(guān)鍵。高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸時(shí)間僅需常規(guī)Taq聚合酶1/3-1/2的時(shí)間，即可維持較高擴(kuò)增效率。
可見(jiàn)，qPCR儀的快速升降溫能力與快速PCR功能模式，相互獨(dú)立又能相互協(xié)同，珠聯(lián)璧合，有助于實(shí)現(xiàn)快速高效PCR分析檢測(cè)。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀升降溫速度性能的意義
在明確qPCR儀熱循環(huán)模塊升降溫速度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性的提質(zhì)、和對(duì)實(shí)驗(yàn)管理效率增效的作用后，速度快、精度高、均一性好就可作為實(shí)時(shí)定量PCR儀選型的重要策略。
當(dāng)升降溫速度接近時(shí)，0.2ml標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)模塊的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀既有快速變溫優(yōu)勢(shì)，又能照顧多數(shù)人的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，無(wú)疑非常穩(wěn)妥。而0.1ml快速反應(yīng)模塊具有支持10～30ul小體積、反應(yīng)管內(nèi)蒸發(fā)死腔小、壁薄熱導(dǎo)效率高、樣品升降溫效能高特定，在滿足檢測(cè)限度要求情況下，工作效能無(wú)疑要更高。
如果要為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀劃一個(gè)控溫性能指標(biāo)，升溫速度達(dá)到多少才算“先進(jìn)、夠用”？我們不妨看看在國(guó)外高IF刊文中牛人用的是何種性能檔次的qPCR系統(tǒng)。
表3 2019至2021 qPCR實(shí)驗(yàn)儀器型號(hào)與發(fā)文數(shù)量表
品牌型號(hào) ABI 7300 ABI 7500 ABI 7500 Fast ABI StepOne Plus ABI
ViiA 7 ABI QuantiStudio系列 Bio-Rad
CFX96 系列 Roche
LightCycler 480 II
上市年份 2004 2004 2005 2007 2010 2013/2018 2018/2018 2008
升溫速度 1.6℃/s 2.5℃/s 5.5℃/s 4.6℃/s 5.5℃/s 3.5-6.5℃/s 5.0℃/s 4.8℃/s
檢索詞  7300 Real-Time PCR 7500 Real-Time PCR 7500 Fast Real-Time PCR StepOne Plus ViiA7 + PCR QuantiStudio CFX96 Touch、
CFX96 Real-Time PCR LightCycler 480 II
發(fā)文數(shù)量 1239篇 4269篇 2959篇 61篇 1190篇 39篇 2518篇 974篇
備注 檢索選項(xiàng):[Text Word]
檢索時(shí)間跨度："2019/01/01"[PubDate] : "2021/08/01"[PubDate]
（數(shù)據(jù)來(lái)源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）
表3顯示，論文中使用最多的是7500型，其次是7500 Fast、CFX96、7300、ViiA7、LightCycler 480 II、StepOne Plus和QuantiStudio系列機(jī)型。上市較早、升溫速度2.5℃/s的7500竟遠(yuǎn)超同期上市、升溫速度更快7500 Fast、LightCycler 480 II及后起之秀ViiA7和伯樂(lè)CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
表4 高影響因子發(fā)文作者單位舉例
品牌機(jī)型 發(fā)文單位/期刊名稱
ABI 7300 J. Exp. Med. (2021)
Cornell University College of Veterinary Medicine Cell Death and Disease(2021)
Huashan Hospital, Fudan University Stem Cell Research & Therapy(2021)
Chinese PLA General Hospital & Tsinghua University, Shenzhen Nat Commun(2021)
School of Basic Medical Sciences, Shandong University eLife(2021)
University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh
ABI 7500 Cell Death and Disease(2021)
Zhongshan Hospital Qingpu Branch,Fudan University Cell Death and Disease(2021)
Fudan University Cell Death and Disease(2021)
Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine J Exp Med.(2021)
Cornell University College of Veterinary Medicine Cell Death and Disease(2021)
Soochow University
（數(shù)據(jù)來(lái)源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）
在IF 8.0以上期刊眾多文章中，既有不差錢的美國(guó)研究機(jī)構(gòu)，也有諸如復(fù)旦大學(xué)及附屬醫(yī)院、上海交大附屬醫(yī)院、清華深圳研究院、山東大學(xué)、蘇州大學(xué)等科研條件較好的國(guó)內(nèi)院校。在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)達(dá)人手中，面世已16年的7300和7500兩款老qPCR儀，依舊熠熠生輝。使用了其檢測(cè)數(shù)據(jù)的研究結(jié)果被榮幸刊發(fā)在J. Exp. Med.、Nat Commun這類Top級(jí)牛刊上。
話說(shuō)回來(lái)，調(diào)研證實(shí)，升溫速度快的7500Fast、7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀發(fā)文用戶，顯然比7300的用戶多得多。說(shuō)明更高更快的運(yùn)行體驗(yàn)更受科研人員待見(jiàn)，這是事實(shí)。
就小型實(shí)驗(yàn)室qPCR儀而言，對(duì)比QuantiStudio 1(最高升溫速率3.5℃/s，三檢測(cè)通道)和CFX Concet(最高升溫速率5.0℃/s，平均升降溫速率 3.3℃/s，三檢測(cè)通道)，CFX Concet變溫速度更高，實(shí)驗(yàn)效能更高。參考文獻(xiàn)
Stephen A. Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A. Garson, et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.Clinical Chemistry,2009 Apr;55(4):611-22
吳瀟韞,王忠華.德國(guó)耶???應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-1

二、樣品模塊變溫速度影響PCR產(chǎn)物特異性

       在PCR儀服務(wù)工作中，屢屢聽到科研人員反映：同一個(gè)片段，用某品牌PCR儀可以有效擴(kuò)增，換個(gè)品牌機(jī)器擴(kuò)增會(huì)失敗。雖然所言具體細(xì)節(jié)難以確認(rèn)，但其實(shí)這反映的是PCR和qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性的問(wèn)題。

       熱循環(huán)模塊升降溫速度對(duì)PCR產(chǎn)物特異性有影響，這在業(yè)內(nèi)是有共識(shí)的。

       Eppendorf的資料說(shuō)明，PCR樣品在變性-退火-延伸三個(gè)步驟間的升降溫速率屬性，影響PCR 結(jié)果可重復(fù)性。PCR反應(yīng)模塊溫控速率的變化，會(huì)使PCR產(chǎn)物凝膠電泳帶型改變。這在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 分析（RAPD）實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)尤為顯著。此外。變溫速率的不穩(wěn)定對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的危害，類似于模塊控溫誤差帶來(lái)的干擾。

       短串聯(lián)重復(fù)序列(STR) 在基因組中的重復(fù)數(shù)量在個(gè)體間呈高度多態(tài)性。采用PCR儀擴(kuò)增STR的檢測(cè)分析是物種系統(tǒng)發(fā)育、司法物證與民事親子鑒定等領(lǐng)域的重要手段。耶拿公司人士認(rèn)為，高速PCR擴(kuò)增STR具有特異性好的巨大優(yōu)勢(shì)。

       說(shuō)明，不僅是PCR熱循環(huán)模塊溫度控制精確性和均一性，升降溫速度控制也影響qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定。

       眾所周知，溫度準(zhǔn)確有效是PCR反應(yīng)的靈魂。表1也顯示，20年來(lái)，PCR模塊溫度控制的均一性從±0.50℃提到±0.2℃，溫控精度一直保持在±0.2-0.3℃。提高反應(yīng)模塊的溫度控制精度和內(nèi)部溫度均一性，確保PCR反應(yīng)組分盡可能處于設(shè)定的有利溫度而非偏離設(shè)定溫度，可提升PCR擴(kuò)增效率，減少錯(cuò)誤和非特異性反應(yīng)。

       熱循環(huán)模塊升降溫速度影響PCR反應(yīng)特異性的原因在于，PCR模塊的快速變溫，使熱循環(huán)步驟中溫度轉(zhuǎn)換過(guò)程時(shí)間占比大幅縮短。反應(yīng)體系處于中間過(guò)渡溫度環(huán)境的時(shí)間極大壓縮，而保持在實(shí)驗(yàn)“有效溫度”的時(shí)間比例大幅增加。這相當(dāng)于提升了模塊保持有效設(shè)定溫度時(shí)間的能力。

       72-95℃高溫停留時(shí)間越長(zhǎng)，PCR反應(yīng)體系蒸發(fā)進(jìn)入管內(nèi)死腔水份越多，體系濃縮越嚴(yán)重，會(huì)使PCR擴(kuò)增效率下降。而55-72℃階段，引物具有一定程度同源的核酸片段的復(fù)性延伸，爭(zhēng)奪體系中Taq酶和合成原料資源，對(duì)模板擴(kuò)增構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)抑制效應(yīng)。反之，循環(huán)過(guò)程溫度偏離設(shè)定點(diǎn)少，擴(kuò)增失誤少，必然有助于提高擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量并減少異常溫度條件下引起的非特異結(jié)合。PCR可靠性增高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性改善則順理成章。

       qPCR儀誕生20多年來(lái)，當(dāng)提升模塊溫控精度和溫度均一性潛能掘盡后，改進(jìn)模塊工藝材料和溫度控制元件性能，大幅加快熱循環(huán)模塊升降溫速度，成為實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀發(fā)展史上具有里程碑意義的進(jìn)步。

       目前主流qPCR儀，如伯樂(lè)新上市的CFX Duet、CFX Opus 96系統(tǒng)，其96孔反應(yīng)模塊最大升降溫速率為5℃/秒（平均升降溫速率3.3℃/秒）。Applied Biosystems QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro/ 6 Flex和QuantStudio 7 Pro/7Flex系列的標(biāo)準(zhǔn)96×0.2mL模塊，最高升溫速率達(dá)到6.5℃/秒，而96×0.1mL模塊的這一指標(biāo)更是躍升至9.0℃/秒。

       羅氏LightCycler 2.0的毛細(xì)管離心式反應(yīng)模塊，升溫速度更是高達(dá)20℃。其初衷就在于盡可能減少溫度過(guò)渡時(shí)間，從而把樣品體系鎖定在設(shè)定溫度上，確保PCR檢測(cè)性能。 

三、qPCR儀快速升降溫能力讓快速PCR功能如虎添翼

       一般認(rèn)為，快速PCR儀/qPCR儀意指PCR模塊具有快速變溫能力（通常升溫速度不低于5.0℃/s），比普通PCR反應(yīng)模塊可有效縮短反應(yīng)時(shí)間。業(yè)內(nèi)將升溫速度達(dá)到4℃配置0.1mL模塊的qPCR儀冠名為快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，以區(qū)別于標(biāo)準(zhǔn)0.2ml模塊機(jī)型。

       而快速PCR功能是指PCR熱循環(huán)過(guò)程采用快速反應(yīng)模式。核心是qPCR儀系統(tǒng)預(yù)置快速反應(yīng)功能模式，并不局限于具備超快升降溫速度模塊。賽默飛StepOne Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，就有標(biāo)準(zhǔn)模式和快速反應(yīng)模式，雖然其最高升溫速度僅4.6℃/s。同樣的，7500 Fast（升降溫速率5.5℃/s）也支持快速模式和標(biāo)準(zhǔn)模式兩種運(yùn)行程序?？焖龠\(yùn)行功能模式，可在40分鐘內(nèi)完成標(biāo)準(zhǔn)模式下近2小時(shí)的擴(kuò)增任務(wù)。

       通常，要實(shí)現(xiàn)快速PCR反應(yīng)，必須三管齊下。

       一是用薄壁0.1mL PCR管或PCR板(如伯樂(lè)low-profile耗材)和專用0.1mL Fast反應(yīng)模塊。模塊升降溫迅速是基礎(chǔ)，而壁薄導(dǎo)熱迅速，加之反應(yīng)體積小，升降溫變得更敏捷；

       二是壓縮熱循環(huán)各步驟的保持時(shí)間，這是有效且立竿見(jiàn)影的舉措。譬如根據(jù)模板片段長(zhǎng)度，將退火15s縮短為5-10s，延伸時(shí)間由30s縮短至10-15s。如果引物的退火和延伸溫度相差無(wú)幾，則可將它們合并，這樣變標(biāo)準(zhǔn)PCR程序變性96℃、56℃退火、72℃延伸三步為95℃變性、72℃延伸兩步后，可進(jìn)一步縮短PCR運(yùn)行時(shí)間。

       三是采用高擴(kuò)增能力DNA聚合酶，這是實(shí)現(xiàn)快速PCR和PCR擴(kuò)增穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的關(guān)鍵。高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸時(shí)間僅需常規(guī)Taq聚合酶1/3-1/2的時(shí)間，即可維持較高擴(kuò)增效率。

       可見(jiàn)，qPCR儀的快速升降溫能力與快速PCR功能模式，相互獨(dú)立又能相互協(xié)同，珠聯(lián)璧合，有助于實(shí)現(xiàn)快速高效PCR分析檢測(cè)。 

四、升降溫速度性能對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀選型的指導(dǎo)意義

       在明確qPCR儀熱循環(huán)模塊升降溫速度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性的提質(zhì)、和對(duì)實(shí)驗(yàn)管理效率增效的作用后，速度快、精度高、均一性好就可作為實(shí)時(shí)定量PCR儀選型的重要策略。

       當(dāng)升降溫速度接近時(shí)，0.2ml標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)模塊的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀既有快速變溫優(yōu)勢(shì)，又能照顧多數(shù)人的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，無(wú)疑非常穩(wěn)妥。而0.1ml快速反應(yīng)模塊具有支持10～30ul小體積、反應(yīng)管內(nèi)蒸發(fā)死腔小、壁薄熱導(dǎo)效率高、樣品升降溫效能高特定，在滿足檢測(cè)限度要求情況下，工作效能無(wú)疑要更高。

       如果要為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀劃一個(gè)控溫性能指標(biāo)，升溫速度達(dá)到多少才算“先進(jìn)、夠用”？我們不妨看看在國(guó)外高IF刊文中牛人用的是何種性能檔次的qPCR系統(tǒng)。

表3 2019至2021 qPCR實(shí)驗(yàn)儀器型號(hào)與發(fā)文數(shù)量表

（數(shù)據(jù)來(lái)源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）

       表3顯示，論文中使用最多的是7500型，其次是7500 Fast、CFX96、7300、ViiA7、LightCycler 480 II、StepOne Plus和QuantiStudio系列機(jī)型。上市較早、升溫速度2.5℃/s的7500竟遠(yuǎn)超同期上市、升溫速度更快7500 Fast、LightCycler 480 II及后起之秀ViiA7和伯樂(lè)CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

表4 高影響因子期刊發(fā)文作者單位舉例

（數(shù)據(jù)來(lái)源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）

       在IF 8.0以上期刊眾多文章中，既有不差錢的美國(guó)研究機(jī)構(gòu)，也有諸如復(fù)旦大學(xué)及附屬醫(yī)院、上海交大附屬醫(yī)院、清華深圳研究院、山東大學(xué)、蘇州大學(xué)等科研條件較好的國(guó)內(nèi)院校。在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)達(dá)人手中，面世已16年的7300和7500兩款老qPCR儀仍是熠熠生輝，檢測(cè)結(jié)果依舊深受這般牛人、?？男刨?。

       不過(guò)，話說(shuō)回來(lái)，調(diào)研證實(shí)，升溫速度快的7500Fast、7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀發(fā)文用戶，顯然比7300的用戶多得多。說(shuō)明更高更快的運(yùn)行體驗(yàn)更受科研人員待見(jiàn)是無(wú)疑的。

       就小型實(shí)驗(yàn)室qPCR儀而言，對(duì)比QuantiStudio 1(最高升溫速率3.5℃/s，三檢測(cè)通道)CFX Duet最（高升溫速率5.0℃/s，平均升降溫速率 3.3℃/s，三檢測(cè)通道)，顯而易見(jiàn)，后者變溫速度更高，當(dāng)然是實(shí)驗(yàn)效能更高。 

參考文獻(xiàn)

［1］Stephen A. Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A. Garson, et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.Clinical Chemistry,2009 Apr;55(4):611-22

［2］吳瀟韞,王忠華.德國(guó)耶拿高速PCR之典范SpeedCycler 2