關(guān)于核酸濃度純度測(cè)定具體指標(biāo)的問(wèn)題，《MIQE指南對(duì)qPCR實(shí)驗(yàn)中核酸紫外測(cè)定的要求-下》已有專(zhuān)門(mén)討論，即核酸純度評(píng)估應(yīng)采用A260/A280、A260/A230雙比值法，核酸濃度測(cè)定用A260指標(biāo)即可，核酸樣品的濃度、純度測(cè)定不可偏廢。

       主流微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)的核酸測(cè)定應(yīng)用程序，所建立的標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)試和報(bào)告體系，通常都具備以下功能特征：

        1）若是用非標(biāo)準(zhǔn)比色皿光程進(jìn)行的吸光度檢測(cè)，系統(tǒng)會(huì)按先長(zhǎng)（光程）后短（光程）的次序自動(dòng)進(jìn)行多光程的吸光度測(cè)定，自動(dòng)選擇最佳測(cè)試光程（介于1.0mm和0.03mm之間）下讀數(shù)作為計(jì)算依據(jù)。軟件自動(dòng)將測(cè)定初始值歸一化為10mm光程的當(dāng)量值，用于計(jì)算核酸濃度、A260/A230和A260/A280比率；

        2）雙鏈DNA（dsDNA）、單鏈DNA（ssDNA）或RNA樣品測(cè)定完成，系統(tǒng)默認(rèn)報(bào)告核酸濃度、兩個(gè)吸光度比值（A260/A280和A260/A230）和吸光度-濃度換算系數(shù)；

        3）核酸濃度以選中的單位（即ng/μL、μg/μL或μg/mL）報(bào)告。計(jì)算公式為：

                                         c=A·f

其中：

A：歸一化為10mm光程的吸光度，以吸光度單位(A)表示；

F：吸光度-核酸濃度計(jì)算系數(shù)的單位為ng-cm/μL。雙鏈DNA系數(shù)為50 ng-cm/μL；單鏈DNA系數(shù)為33 ng-cm/μL；RNA系數(shù)為40 ng-cm/μL；

C：濃度單位為ng/μL。

       以NanoDrop One、NanoDrop OneC微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)的dsDNA測(cè)定為例，測(cè)定結(jié)果報(bào)告自動(dòng)給出濃度（單位ng/μL）、A260/A280計(jì)算值、A260/A230計(jì)算值、A260和A280測(cè)定值。                                              

       NanoDrop One dsDNA樣品測(cè)試結(jié)果的報(bào)告界面還標(biāo)注了結(jié)果計(jì)算中采用了340nm 基線矯正（Baseline Correction）算法。正常情況下，純化的核酸樣品吸收波長(zhǎng)掃描曲線，存在一峰（260nm吸收峰）、一谷（230nm吸收低谷）和一平（340nm波長(zhǎng)開(kāi)始光吸收降低到0，與檢測(cè)器背景信號(hào)基線近乎平行）。但因不同測(cè)試溶液條件和檢測(cè)器自身背景信號(hào)，樣品吸光度值可能存在偏差。所謂基線矯正，是指系統(tǒng)從樣品所有波長(zhǎng)的吸光度值（如核酸的A260、A280和A230原始測(cè)定值）減去指定基線矯正波長(zhǎng)的吸光度值（如核酸常用的A340），對(duì)測(cè)試值進(jìn)行修正。

       Implen NanoPhotometer NP80、N60、N50微量紫外光度計(jì)的DNA測(cè)定結(jié)果報(bào)告中，系統(tǒng)給出了測(cè)定物質(zhì)和測(cè)定方法、ng/μL濃度、消光系數(shù)、A260/A280值、A260/A230值、A230 、A260和A280測(cè)定值，并對(duì)存在異常的測(cè)定值予以警示標(biāo)志。

       資料顯示，國(guó)產(chǎn)的Nano 100、Nano 300微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)的核酸樣品測(cè)試結(jié)果報(bào)告中，所列事項(xiàng)與前述兩款進(jìn)口機(jī)型此基本一致。

       NanoVolume類(lèi)微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)，無(wú)論是NanoDrop One、NanoDrop Eight、NanoPhotometerNP80/N60/N50、Nano300等全波長(zhǎng)掃描功能的標(biāo)準(zhǔn)機(jī)型，還是NanoDrop Lite Plus和Nano 400這類(lèi)檢測(cè)光源為230nm、260nm、280nm固定波長(zhǎng)的精簡(jiǎn)版型號(hào)，系統(tǒng)預(yù)置測(cè)定協(xié)議生成的測(cè)試報(bào)告事項(xiàng)，完全符合MIQE指南所規(guī)定的核酸質(zhì)量評(píng)估控制要求。這樣，省去繁瑣的參數(shù)設(shè)定和測(cè)定數(shù)據(jù)手工計(jì)算，極大方便了核酸樣品質(zhì)量的測(cè)評(píng)工作。

       如無(wú)現(xiàn)成的NanoVolume紫外測(cè)定工具，如何利用普通紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行核酸純度濃度測(cè)定？

       最經(jīng)濟(jì)易行的解決方案是eppendorf的UVette比色皿。

       UVette比色皿同時(shí)具有兩種光程長(zhǎng)度 ，將UVette 旋轉(zhuǎn) 90°可在10 mm 和2 mm兩種光程間切換。對(duì)于PCR、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，樣品經(jīng)適度稀釋后，參考50μL的加樣量和采用2mm光程進(jìn)行測(cè)定，或許有助于解決微量樣品測(cè)定中的基本難題。

       UVette比色皿具有較好的兼容性。在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試光束高度8.5mm的分光光度計(jì)中，可以直接使用UVette比色皿，其操作方法即與常規(guī)比色皿測(cè)試操作一致。針對(duì)測(cè)試光束距離檢測(cè)池底部的高度為10mm、15mm的光度計(jì)，添加eppendorf提供相應(yīng)比色皿適配器，將適配器-比色皿組合疊加固定后，安裝到標(biāo)準(zhǔn)光程檢測(cè)池內(nèi)測(cè)試即可正常使用。

        通常，綜合應(yīng)用型紫外光度計(jì)儀器檢測(cè)參數(shù)設(shè)置比較繁瑣。它要求操作者對(duì)測(cè)試方法體系了然于胸，同時(shí)還要熟悉儀器本身設(shè)置方法和設(shè)定選項(xiàng)的涵義。

       以日立UH5300的核酸測(cè)定應(yīng)用為例。系統(tǒng)提供了核酸樣品測(cè)量功能模塊，可用于核酸樣品230 nm，260 nm，280 nm和320 nm四個(gè)測(cè)試波長(zhǎng)吸光度測(cè)定，并根據(jù)測(cè)量吸光度和吸光度比（A260 / A280，A260 / A230）計(jì)算核酸的純度，濃度等。

       開(kāi)機(jī)后需完成如下步驟設(shè)置：

測(cè)量條件設(shè)置(Measurement Conditions)

樣品條件設(shè)置(Setting Sample Conditions)

測(cè)量條件設(shè)置(Setting Measurement Conditions)

核酸濃度條件設(shè)置(Setting Nucleic Acid Concentration Conditions)

檢測(cè)池6個(gè)比色皿樣品的設(shè)置（Setting 6 Cells)

對(duì)照項(xiàng)設(shè)置 (Setting Control Items)

打印條件設(shè)置 (Setting Printing Conditions)

保存條件設(shè)置 (Setting Condition Saving)

測(cè)量樣品溶液設(shè)置(Measuring Sample Solution)

保存和打印數(shù)據(jù)設(shè)置(Saving and Printing Data)

       慶幸的是，測(cè)定參數(shù)中的核酸濃度計(jì)算因子、核酸濃度單位、核酸純度、核酸純度比值標(biāo)準(zhǔn)等關(guān)鍵設(shè)置，程序都預(yù)置有可選項(xiàng)，無(wú)須手工輸入。從工作界面上看，與NanoDrop One、NanoPhotometer N60 和Nano 300等生物學(xué)專(zhuān)用微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)比，UH5300的應(yīng)用程序中并未將核酸具體類(lèi)型細(xì)分，Expected Ration、Nucleic Acid Conc factor與核酸類(lèi)型間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，實(shí)驗(yàn)者必須十分熟悉且準(zhǔn)確無(wú)誤才行。

參考文獻(xiàn)
NanoDrop One Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Rev. E)
NanoPhotometer N120/NP80/N60/N50/C40 User Manual (Version 4.3.4)
Nano-300 微量分光光度計(jì)操作手冊(cè)(Version 2.0)
Eppendorf UVette Universal Adapter Use Instructions
Model Uh5300 Spectrophotometer Instruction Manual